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백신 유발 면역을 연구하려면 무세포 백일해 백신으로 채워진 주사를 맞으십시오. 이 백신에는 호흡기 질환을 유발하는 박테리아인 보르데텔라 백일해의 항원 단백질과 지속적인 면역 반응을 위해 항원 노출을 확장하는 보조제가 포함되어 있습니다.
마취된 마우스에 백신을 근육 주사합니다.
주사 후 상주 항원 제시 세포인 APC는 항원 단백질을 포획하여 펩타이드로 가공하여 표면에 제시합니다. 그런 다음 이러한 APC는 인근 림프절로 이동하여 T 세포와 상호 작용하여 활성화 및 이펙터 T 세포로의 분화를 시작합니다.
이러한 이펙터 T 세포는 순환하여 폐를 포함한 다양한 기관으로 이동하여 상주 기억 T 세포 또는 TRM 세포로 상주하여 면역화를 유도합니다.
예방접종 후 살아있는 보르데텔라 백일해의 항생제 내성 균주를 비강내 투여합니다. 이 박테리아는 폐 조직으로 들어가 TRM 세포를 활성화합니다. 활성화된 TRM 세포는 면역 세포를 모집하여 박테리아 제거를 유발하는 염증성 사이토카인을 분비합니다.
마우스의 폐 조직을 채취하고 균질화하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 희석된 세포 현탁액을 항생제 함유 한천 플레이트에 펴 바르고 배양하여 박테리아 콜로니 형성을 허용합니다.
면역화된 마우스의 조직 추출물은 면역되지 않은 마우스의 조직 추출물에 비해 더 적은 수의 콜로니를 나타내며, 이는 보르데텔라 백일해에 대한 백신 유도 면역을 확인합니다.
예방접종을 위해 마취된 6주에서 12주 된 마우스에서 발가락 꼬집기에 대한 반응 부족을 확인하고 28.5게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 인슐린 주사기에 관심 백신 0.1밀리리터를 로드합니다. 베벨이 위를 향하도록 주사기를 45도 각도로 잡고 바늘을 마우스의 삼각근에 약 5mm 삽입하고 백신을 주입합니다.
바늘을 근육에 5-10초 동안 삽입한 상태로 유지합니다. 그런 다음 주사기를 180도 회전시켜 베벨이 아래를 향하도록 하여 밀봉을 만들고 백신 누출을 방지한 후 주사 부위에서 바늘을 천천히 집어넣습니다. 그런 다음 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 케이지로 되돌립니다.
부스터 접종 후 약 2주 후에 면역화된 마우스를 감염시킵니다. 마취된 마우스의 견갑골과 목 뒤의 등쪽 흉부 목덜미를 잡고 마우스를 똑바로 세워 코에 접근합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여, 20-25마이크로리터의 관심 박테리아 접종물을 동물의 각 층에 천천히 도포하고, 전체 접종물이 흡입될 때까지 마우스를 잡는다. 그런 다음 동일한 부피의 멸균 PBS를 음성 대조군으로 한 그룹의 마우스에 전달합니다.
적절한 실험 종점에서 감염된 마우스 복부 면이 위로 향하도록 해부 보드에 놓고 팔다리를 고정합니다. 70% 에탄올로 몸을 적시고 집게를 사용하여 골반 중앙의 복부 아래 피부를 감싸십시오. 날카로운 가위를 사용하여 하악까지 수직으로 절단하고 복막벽에서 피부를 해부합니다. 피부를 시체 옆으로 움직여 무균 장기 적출을 위한 막힘 없는 필드를 만들고 간 또는 그 근처의 흉곽 아래의 온전한 복막을 잡습니다. 복막을 흉곽 쪽으로 절단하여 하부 소화관을 노출시키고 결장을 왼쪽으로 움직여 비장을 드러냅니다.
구부러진 집게를 사용하여 비장을 잡고 가위로 결합 조직을 해부합니다. 그런 다음 비장을 3밀리리터의 RPMI와 5% 소 태아 혈청이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브에 얼음 위에 놓습니다. 겸자를 사용하여 검상돌기에서 흉곽을 안정시키고 횡격막을 절단합니다. 폐는 수축되어 척추 쪽으로 떨어져야 합니다.
흉갑을 제거하기 위해 측면의 흉곽을 절단하고 폐동맥과 정맥을 절단하여 오른쪽 폐의 상엽을 분리하여 제거합니다. 10% 중성 완충 포르말린의 15밀리리터 원뿔형 튜브에 엽을 실온에서 최소 24시간 동안 고정하고 오른쪽 및 왼쪽 폐의 나머지 엽을 분리합니다. 그런 다음 얼음 위의 PBS에 2밀리리터의 1% 카제인이 들어 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브에 엽을 넣습니다.
팁이 있는 1밀리리터 PIPETMAN을 사용하여 흉강을 채우는 혈액을 채취하고 얼음 위에 미리 라벨이 붙은 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 혈액을 옮깁니다. 이하선, 설하선, 상악하선, 기관을 덮고 있는 림프절을 제거하고 기관을 둘러싼 보호막을 열어 제거합니다. 가는 집게와 가위를 사용하여 식도에서 기관을 조심스럽게 분리하고 쇄골 상단에서 하악 하단까지 기타 결합 조직을 분리합니다.
겸자를 사용하여 기관을 잡고 쇄골 상단의 기관을 절단합니다. 기관을 아래로 당겨 탄력을 극대화하고, 후두 바로 위의 하악 하단의 기관을 절단하여 약 1cm의 조직을 분리합니다. 그런 다음 얼음 위의 PBS에 0.3밀리리터의 1% 카제인이 들어 있는 미리 표지된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 장기를 넣습니다.
이제 코에 쉽게 접근할 수 있도록 마우스를 돌리고 머리에 70% 에탄올을 뿌립니다. 손으로 두개골 바로 뒤에 있는 동물을 잡고 가위를 사용하여 코 바닥에서 시작하여 위쪽으로 움직여 주둥이의 부드러운 살을 잘라냅니다. 코 주위의 털, 피부, 수염을 제거하고 곡선이 아래를 향하도록 구부러진 가위의 끝을 콧구멍에 삽입합니다.
눈 쪽으로 비강을 잘라 V자 모양을 만듭니다. 그런 다음 미세한 집게를 사용하여 구조물 내의 비중격과 연조직을 수집하고 얼음 위의 PBS에 0.3밀리리터의 1% 카제인이 들어 있는 사전 라벨이 부착된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 조직을 넣습니다.
폐 조직을 처리하려면 전체 폐 샘플 튜브 내용물을 멸균 15밀리리터 dounce 균질화기로 옮기고 유봉을 사용하여 조직을 균질화합니다. 큰 조직 입자가 남지 않을 때까지 샘플을 해리하고 균질화된 현탁액을 원래의 15밀리리터 튜브로 되돌립니다. 콜로니 형성 단위를 도금하기 위해 0.3밀리리터 분취량을 제거하고 원심분리에 의해 균질의 나머지 부분을 수집합니다.
ELISA에 의한 사이토카인 발현 분석이 있을 때까지 섭씨 음20도에서 보관하기 위해 사전 표지된 미세 원심분리기 튜브에 상청액 0.5밀리리터를 분취합니다. 그런 다음, 따로 보관된 균질화된 폐 현탁액의 0.1밀리리터 분취량을 희석액당 0.9밀리리터의 멸균 PBS에 연속적으로 희석하고, 멸균 삼각형 스프레더를 사용하여 경험적으로 선택된 각 희석액 0.1밀리리터를 사전 표지된 10% Bordet-Gengou 플러스 스트렙토마이신 플레이트에 도금합니다.