JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 3:24 분 • July 8th, 2025
B 림프구의 B 세포 수용체인 BCR은 항원에 결합하여 세포 활성화를 유발합니다. 이는 효과적인 면역 반응을 생성하기 위해 도우미 T 림프구에 제시하기 위해 클래스 II MHC 분자에 로드되는 펩타이드 단편으로 처리하기 위한 항원 내재화로 이어집니다.
항원 코팅 비드를 사용하여 시험관 내에서 B 림프구 활성화를 연구하려면 먼저 항원 코팅 비드를 얻습니다. 이 비드는 항원, BCR에 특이적인 리간드로 공유 코팅되어 있습니다. 비반응성 단백질은 결합되지 않은 비드 부위를 차단하여 비특이적 B 림프구 결합을 방지합니다.
B 림프구 현탁액에 비드를 추가합니다. 혼합물을 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립에 시드합니다.
음전하를 띤 B 림프구는 양전하를 띤 커버슬립에 결합하여 세포를 고정시킵니다. 또한, 비드의 항원은 BCR에 특이적으로 결합합니다. BCR과 항원의 상호 작용은 B 림프구를 활성화하여 긴밀한 접합(면역 시냅스)을 형성합니다.
상호 작용은 세포 내 신호 전달 경로를 시작하여 액틴 세포골격 재구성을 초래합니다. 이것은 세포막 확산 후 수축을 유발하며, 그 동안 BCR-항원 마이크로클러스터는 면역 시냅스 센터에 집중됩니다.
액틴 리모델링을 통해 미세소관 조직 중심체인 중심체는 시냅스 근처에서 재배치됩니다. 재배치는 면역 시냅스 근처의 리소좀 및 골지 장치와 같은 소기관을 모집하여 항원을 추출하고 제시합니다.
항원 코팅 비드는 아미노기를 활성화하기 위해 이전에 글루타르알데히드로 처리된 아미노 비드와 특정 리간드를 배양하여 제조됩니다. 활성화된 비드를 100마이크로리터의 PBS와 와류에 재현탁합니다. 한편, 150마이크로리터의 PBS에 BCR 리간드 ml당 100마이크로그램을 첨가하여 항원 용액을 준비한다.
다음으로, 50마이크로리터의 활성화된 비드를 항원 용액에 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 또한 관련 없는 리간드를 음성 대조군으로 사용하십시오. 배양 후 PBS로 비드를 세척하고 상청액을 흡인한 후 PBS로 교체합니다. 세 번 반복합니다. 다음으로, BSA 용액 500마이크로리터에 비드를 재현탁시켜 유리 아미노기를 차단합니다. 마지막으로 70마이크로리터의 PBS에 비드를 재현탁합니다.
최종 농도를 계산하려면 혈구계를 사용하여 구슬을 세는 것이 좋습니다. B 세포 활성화를 위해 50ml 튜브를 사용하고 5% 소 태아 혈청이 보충된 CLICK에서 ml당 150만 농도로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 세포-비드 혼합물에 해당하는 150,000개의 B-세포를 폴리-L-라이신 코팅된 커버슬립에 첨가하고 서로 다른 시점 동안 37도에서 배양합니다.