생쥐 골수 세포의 골수 형성에 대한 Anti C-fms 항체의 효과시험관 내

파골세포 형성은 파골세포 전구체가 분화 및 융합하여 다핵 파골세포를 형성하는 과정입니다.

시험관 내에서 파골세포 형성에 대한 항-c-fms 항체의 효과를 연구하기 위해 마우스 골수 세포 현탁액이 들어 있는 배양 플레이트를 채취하십시오. 대식세포 콜로니 자극 인자인 M-CSF를 추가합니다.

배양에서 M-CSF는 골수 전구체 세포의 특정 수용체인 c-fms에 결합하여 신호 전달 경로를 활성화하고 파골세포 전구체를 나타내고 플레이트에 부착하는 골수 대식세포(BMM)로 분화합니다.

비부착 세포를 제거합니다. BMM을 수확하여 멀티웰 플레이트 웰에 파종합니다. M-CSF 및 핵 인자 카파-Β 리간드의 수용체 활성화제인 RANKL을 보충합니다.

증가하는 항-c-fms 항체 농도를 웰에 추가합니다.

대조군 웰에서 M-CSF는 c-fms 수용체에 결합하고 신호 전달 경로를 활성화하여 RANK 수용체 발현을 자극하고 BMM 생존 및 증식을 촉진합니다. RANKL은 RANK 수용체에 결합하여 신호 전달 캐스케이드를 유발하고 BMM 분화 및 파골세포로의 융합을 유발합니다.

항체 농도가 높은 웰에서 항체는 c-fms 수용체에 결합하여 효과적으로 차단하고 파골세포 분화에 필요한 신호 전달을 방해하여 파골세포 형성을 억제합니다.

색을 수행하여 파골세포 집단을 식별 및 정량화하고 RANKL 유도 파골세포 형성에서 파골세포 형성을 억제하는 효과적인 항체 농도를 결정합니다.

10cm 배양 접시에 10밀리리터당 1,000만 개의 세포를 파종하고 세포에 M-CSF를 첨가합니다. 배양액을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3일 동안 배양합니다. 3일 후에 배지를 제거하고 10밀리리터의 PBS로 세포를 2회 세게 세척하여 비부착 세포를 제거합니다.

PBS에 실온 0.02% 트립신-EDTA 5밀리리터를 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 완전히 피펫팅하여 분리합니다. 현미경으로 배양물을 관찰하여 세포가 분리되고 배지에 둥글고 떠 있는 것처럼 보이는지 확인합니다.

세포가 분리되면 5밀리리터의 알파-MEM을 첨가하여 반응을 비활성화합니다. 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 알파-MEM 5밀리리터로 세척하고 다시 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 10밀리리터의 알파-MEM에 재현탁합니다.

10cm 배양 접시에 10밀리리터당 100만 개의 세포를 파종하고 M-CSF를 첨가합니다. 배양액을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3일 동안 배양합니다. 3일 후에 BMM을 파골세포 전구체로 나타내는 부착된 세포를 수확합니다. 웰당 96웰 플레이트에서 알파-MEM 200마이크로리터당 50,000개의 세포로 BMM을 시종합니다.

각 웰에 원하는 자극을 추가한 다음 밀리리터당 100나노그램의 최종 농도를 위해 M-CSF를 추가합니다. 각 웰에 항-c-fms 항체를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4일 동안 배양한 다음 격일로 배지를 4일 동안 교체한 다음 원고에 설명된 대로 염색 및 분석을 진행합니다.