성충 파리의 숙주-바이러스 상호작용을 연구하기 위한 흉곽내 바이러스 나노 주사

마취된 야생형 및 Dicer-2 돌연변이 수컷 초파리를 입체 현미경 아래 주사 접시에 담습니다. 파리에 RNA 바이러스 복제를 억제하는 공생 박테리아가 없는지 확인하십시오.

포지티브 센스, 단일 가닥 RNA 바이러스 현탁액을 포함하는 나노 인젝터로 파리를 흉부 내 접종합니다.

바이러스는 수용체 매개 엔도사이토시스를 통해 숙주 세포에 들어가 복제하여 이중 가닥 중간 RNA를 생성합니다. 숙주 패턴 인식 수용체 Dicer-2는 바이러스 이중 가닥 RNA를 작은 간섭 RNA, siRNA로 처리합니다.

siRNA는 RNA 유도 침묵 복합체인 RISC에 결합하여 상보적 가닥이 제거됩니다. RISC가 탑재된 siRNA는 상보적인 염기 쌍을 통해 다른 바이러스 RNA에 결합하여 바이러스 RNA 분해 및 유전자 침묵을 유발합니다.

Dicer-2와 바이러스 RNA 상호 작용은 다운스트림 항바이러스 신호 캐스케이드를 활성화하여 항바이러스 단백질을 생성합니다. 이러한 항바이러스 단백질은 인접 숙주 세포의 Janus 키나아제 또는 JAK, 단백질 결합 사이토카인 수용체와 상호 작용하여 수용체 이량체화 및 JAK 인산화를 시작합니다.

활성화된 JAK는 신호 변환기 및 전사 활성화제인 STAT 단백질을 인산화하고 활성화합니다. 활성화된 STAT는 핵으로 전위하고 특정 DNA 서열에 결합하여 항바이러스 반응 유전자의 전사를 시작합니다.

원하는 기간 동안 파리를 키우십시오.

다운스트림 분석은 Dicer-2 돌연변이 파리에서 생존율 감소 및 바이러스 부하 증가를 나타냅니다.

바이러스 감염의 경우 먼저 입체현미경과 얇은 겸자를 사용하여 유리 모세혈관 바늘 끝을 나노 주입에 적합한 직경으로 부수십시오. 인젝터를 조립하려면 씰링 O-링과 흰색 스페이서를 큰 딤플이 바깥쪽을 향하도록 인젝터의 금속 플런저에 놓습니다.

30게이지 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 유리 바늘에 미네랄 오일을 채우고 바늘을 칼라에 통과시킵니다. 바늘의 뭉툭한 끝에서 약 1mm 떨어진 칼라 바닥 주위에 더 큰 O-링을 놓고 바늘을 인젝터의 플런저에 장착합니다.

바늘을 플런저에 고정하고 빈 버튼을 눌러 가청 신호가 들릴 때까지 마이크로인젝터의 플런저를 확장합니다. 이제 채우기를 눌러 플런저를 5mm 후퇴시키고 바늘을 100 플라크 형성 단위 바이러스 현탁액에 담그십시오. 볼바키아가 없는 수컷 초파리 20개가 담긴 1개 또는 최소 3개의 바이알을 주사 접시에 부드럽게 흔듭니다.