세포 내 염색 및 유세포 분석을 통한 사이토카인 생산에 대한 담배 제품 제제의 효과 분석

염증 자극제와의 상호 작용 시 면역 세포는 염증 신호 분자(사이토카인)를 방출하여 면역 반응을 일으킵니다.

담배 제품 제제인 TPP의 효과를 분석하려면 TPP 농도가 증가하는 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포, 면역 세포를 포함하는 PBMC로 플레이트를 파종합니다.

TPP의 면역억제제인 니코틴은 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하여 전염증성 사이토카인 생성을 하향 조절합니다. 이러한 하향 조절은 용량에 따라 다르며 농도가 높을수록 더 중요한 효과가 있습니다.

원심분리하여 세포를 펠릿화하고 TPP 잔류물을 포함하는 상청액을 버립니다.

세포를 완전한 배지에 재현탁하고 면역 자극제인 지질다당류와 단백질 수송 억제제인 GolgiPlug를 포함하는 혼합물을 추가합니다.

지질다당류 분자는 톨 유사 수용체-4를 포함하는 면역 세포와 상호 작용하여 세포 내 신호 전달 경로와 전염증성 사이토카인 생성을 유발합니다. 한편, 골지플러그 분자는 골지체의 사이토카인 분비를 차단하여 축적을 가능하게 합니다.

고정액으로 세포를 고정하고 기공 형성제로 투과시킵니다. 기공을 통해 들어가 각각의 세포내 사이토카인에 결합하는 형광단 태그가 부착된 항사이토카인 항체 칵테일로 세포를 오버레이합니다.

형광 신호를 측정하는 유세포 분석법으로 염색된 세포를 분석합니다.

사이토카인 생산 수준을 결정합니다. 용량 의존적 감소는 TPP의 면역억제 효과를 나타냅니다.

염색 절차를 시작하기 전에 전체 연기 조절 배지와 RPMI 완전 배지에 나열된 농도의 니코틴을 96웰 플레이트에서 웰당 총 부피 100마이크로리터로 희석합니다. 그런 다음, 웰당 총 부피 200마이크로리터에 대해 10 x 10의 농도로 완전 배지에 현탁된 PBMC 100 마이크로리터를 웰당 여섯 번째 세포에 첨가하여 총 부피를 200 마이크로리터로 만듭니다. 그런 다음 플레이트를 덮고 섭씨 37도 및 5% CO₂에서 배양합니다.

3시간 후 세포를 세척하고 상청액을 흡인합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 덮고 소용돌이치게 하여 펠릿을 해리시킵니다. 세포를 얼음처럼 차가운 실행 완충액에서 한 번, 완전 배지에서 한 번 더 세척합니다.

두 번째 세척 후, 섭씨 37도 및 5% CO₂에서 6시간 동안 GolgiPlug 및 LPS를 보충한 완전 배지 웰당 200마이크로리터로 처리합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 러닝 완충액으로 세포를 세척하고 섭씨 4도에서 웰당 100마이크로리터의