황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 체외 생물막 합성(In vitro Biofilm Synthesis)

박테리아 생물막은 숙주 면역 반응을 회피하는 자체 생성 세포외 기질에 내장된 박테리아 군집으로 구성된 3차원 구조입니다.

시험관 내 황색포도상구균 생물막 준비의 경우, 원하는 세포 밀도의 활발하게 성장하는 황색포도상구균 현탁액을 멀티웰 플레이트의 폴리-L-라이신 코팅 웰로 옮깁니다.

정적 조건에서 배양하는 동안 양전하를 띤 폴리-L-라이신 코팅은 박테리아 표면의 테이코산과 같은 음전하를 띤 당중합체와의 정전기 상호 작용을 촉진하여 박테리아 부착을 촉진합니다.

사용 가능한 영양 공급원을 통해 황색포도상구균은 분열하고 축적되어 마이크로콜로니를 형성합니다. 또한 박테리아는 다당류, 단백질 및 세포외 DNA로 구성된 세포외 기질을 분비하여 세포를 감싸고 박테리아 응집력과 표면 접착을 촉진합니다.

지속적인 세포 분열과 매트릭스 분비를 통해 생물막은 세포 간 통신을 위한 효율적인 신호 분자 분포를 가진 3차원 구조로 성숙합니다.

역치 박테리아 밀도에 도달하면 황색포도상구균은 프로테아제와 뉴클레아제를 분비하여 생물막 기질을 분해하고 소수의 황색포도상구균을 배지로 방출합니다. 자유롭게 떠다니는 플랑크톤 박테리아가 포함된 배지를 제거합니다.

생물막 파괴를 방지하기 위해 완충액을 부드럽게 첨가하십시오. 부착되지 않은 박테리아가 남아 있는 완충액을 제거합니다.

생성된 생물막은 다운스트림 실험을 위해 준비되었습니다.

트립틱 대두 한천과 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트에서 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 냉동 보존된 스톡에서 황색포도상구균의 분리된 콜로니를 얻는 것으로 시작합니다. 멸균수에 희석된 100마이크로리터의 PLL로 96웰 플레이트의 개별 웰을 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 무균적으로 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 건조시키십시오.

2% 포도당이 보충된 MEM-알파에 S. aureus 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 분당 200회전으로 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 배양합니다. 50마이크로리터를 2% 포도당이 보충된 신선한 MEM-알파 5밀리리터로 옮겨 하룻밤 배양을 희석합니다. 그런 다음 중간 로그 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 분당 200회전으로 배양합니다. MEM-알파를 사용하여 중간 로그 배양을 OD 0.1로 정규화합니다.

150마이크로리터의 정규화된 배양물을 PLL 처리 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습 챔버에서 18-20시간 동안 배양합니다. 상청액을 흡인하여 플랑크톤 세포를 제거합니다. 남은 바이오매스를 150마이크로리터의 HBSS로 부드럽게 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 모든 플랑크톤 세포를 제거하려면 최소 두 번 반복합니다.