0 조회수 • 3:23 분 • July 8th, 2025
병원성 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자를 통해 림프구를 자극하려면 림프구 및 항원 제시 세포 또는 APC를 포함하여 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 현탁액을 섭취하십시오.
박테리아 현탁액을 첨가하고 생리학적 온도에서 배양합니다.
APC의 패턴 인식 수용체는 박테리아 세포의 특정 구성 요소에 결합하여 식균 작용을 유발합니다. 내재화된 박테리아를 포함하는 포고솜은 리소좀과 융합하여 박테리아 분해를 일으키고 펩타이드 조각으로 가공됩니다.
주요 조직적합성 복합체 또는 MHC 분자는 펩타이드 단편에 결합하여 세포 표면에 항원으로 제시합니다. T 림프구는 T 세포 수용체를 통해 제시된 항원에 결합합니다.
T 림프구의 특정 표면 수용체에 결합하는 공동 자극 항체를 추가합니다. 시너지 결합은 다운스트림 신호 전달을 유도하여 T 림프구 사이토카인 생산을 활성화합니다.
골지체 차단 화합물을 추가하여 소포체에서 골지체로의 소포 단백질 수송을 차단하여 T 림프구의 사이토카인 분비를 억제하여 세포내 사이토카인 축적을 촉진합니다.
세포 형태를 보존하기 위해 고정제를 추가하고 세포막을 투과화하기 위해 세제를 추가합니다. T 림프구 특이적 표면 마커에 결합하는 항체(세포 표면을 표지함)와 세포 내부에 침투하여 세포 내 사이토카인에 결합하는 사이토카인 특이적 항체를 포함하여 형광 표지 항체의 칵테일을 추가합니다.
유세포 분석을 수행하여 이중 형광이 있는 세포를 검출하여 자극된 T 림프구에 의한 사이토카인 생성을 나타냅니다.
말초 혈액 샘플을 조절 및 항원 자극을 위해 분취량으로 나눕니다. 두 샘플에 공동 자극 항체를 추가한 다음 유형화할 수 없는 H. 인플루엔자를 항원 샘플에 추가하고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 골지체 차단제 Brefeldin A를 샘플에 첨가하고 5시간 더 배양합니다. 앞서 설명한 대로 적혈구를 용해한 후, 1% 내지 2% 파라포름알데히드 500마이크로리터를 사용하여 백혈구를 1시간 동안 고정시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수한 다음 100마이크로리터의 0.1% 사포닌으로 100만 개의 세포를 15분 동안 투과화합니다.
다음으로, 적절한 형광 표지 항체와 함께 세포를 배양합니다. 세포를 세척한 다음 유세포 분석기를 사용하여 분석합니다. 관련 림프구 집단을 게이팅하여 항원 반응 세포의 비율을 결정합니다. 분석할 모든 사이토카인에 대해 자극되지 않은 세포에서 배경 염색을 수행합니다.