감염된 인간 조직 유래 세포에서 염증 매개체의 정량화

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감염 중에 활성화된 림프구는 염증 매개체(사이토카인)를 방출하여 면역 반응을 유도합니다.

감염된 조직의 염증 매개체를 정량화하려면 인간 폐 조직 유래 면역 세포를 포함하는 세포 현탁액으로 시작합니다.

호흡기 병원성 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)와 함께 세포를 배양합니다. 박테리아의 표면 항원은 식세포 면역 세포의 패턴 인식 수용체와 상호 작용합니다. 이것은 박테리아 내재화, 더 작은 펩타이드로의 처리 및 주요 조직 적합성 복합체 분자에 의한 펩타이드의 제시를 시작합니다.

식세포의 항원-MHC-II 분자는 공동 자극 수용체 상호작용과 함께 T 세포 수용체를 통해 T 림프구에 결합하여 T 림프구 활성화 및 전염증성 사이토카인 생성을 초래합니다.

골지 차단제로 세포를 처리하여 사이토카인 방출을 손상시켜 세포 내부에 축적을 유발합니다. 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 차단 완충액으로 세포를 세척합니다.

인간 T 림프구 표면 마커에 특이적으로 결합하는 형광단 표지 항체의 혼합물로 세포 현탁액을 염색하여 림프구의 표지를 가능하게 합니다.

세포를 고정하고 기공 형성 계면활성제로 투과시킵니다. 투과화된 세포를 형광단 표지 항-사이토카인 항체와 함께 배양하며, 이는 세포에 들어가 특정 사이토카인과 상호 작용합니다.

유세포 분석을 사용하여 표지된 림프구 내에서 사이토카인 형광 신호를 측정하여 박테리아 감염으로 인한 염증 매개체 생성과 상관관계가 있습니다.

폐엽 절제술 샘플의 약 20-40g을 3-5입방밀리미터 섹션으로 자릅니다. 멸균된 50마이크로리터 챔버 안에 넣고 적절한 분해기를 사용하여 조직을 기계적으로 조각화합니다. 조직 분해 후, 입증된 대로 적혈구를 용해하고 멸균 RPMI에서 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 100마이크로미터 멸균 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과하고 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.

감염 분석을 위해 RPMI에서 폐 세포를 튜브당 밀리리터당 400만 세포의 최종 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 세포당 100개의 박테리아의 MOI로 세포를 감염시킵니다. 튜브에서 가스가 전달될 수 있도록 캡을 반 바퀴 풉니다. 세포를 튜브 회전기에 넣고 섭씨 37도에서 12RPM으로 회전하면서 배양합니다. 자극 1시간 후, 사이토카인의 세포외 수출을 방지하기 위해 Brefeldin A를 첨가하고 세포 현탁액을 회전하면서 추가로 16-22시간 동안 배양합니다.

다음날, 1% 소 혈청 알부민과 0.01% 아지드화나트륨을 함유한 500마이크로리터의 PBS로 세포 현탁액을 세척합니다. 다음으로, 특정 인간 림프구 세포 표면 마커에 대해 세포 현탁액에 1시간 동안 머무릅니다. 그런 다음 PBS로 세포를 세척하고 앞서 설명한 대로 고정 및 투과화합니다. 다음으로, 세포를 세포내 사이토카인 염색 항체와 함께 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 세척하고 유세포 분석기에서 데이터를 수집하기 전에 100마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.

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Last updated: 18 July 2026