Opsonized Biofilm과의 상호 작용에 따른 호중구에 의한 ROS 생산 측정

옵소닌으로 태그된 박테리아는 특정 호중구 수용체에 의해 인식되어 활성 산소종 또는 ROS, 방출 및 박테리아 분해에 의한 식균 작용을 유발합니다.

시험관 내에서 호중구에 의한 ROS 생산을 정량화하려면 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 테스트 웰에는 세포외 기질 필름 포매 박테리아로 구성된 황색포도상구균 생물막이 포함되어 있습니다. 제어 우물에는 생물막이 없습니다.

생물막을 인간 혈청과 함께 배양하여 혈청 옵소닌이 생물막을 옵소니화할 수 있도록 합니다.

혈청을 흡인합니다. 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 옵소닌을 제거합니다. 호중구와 루미놀(화학발광 화합물)을 우물에 첨가하십시오. 원심분리기, 호중구를 생물막 근처로 가져옵니다.

플레이트 리더를 사용하여 시간 경과에 따른 발광을 측정합니다.

생물막 함유 우물에서 호중구는 생물막의 옵소닌에 결합하여 호중구 활성화 및 박테리아가 식체로 내재화됩니다. 특정 신호 전달 경로가 활성화되어 식체에서 NADPH 산화효소 조립을 유발합니다.

NADPH 산화효소는 NADPH에서 분자 산소로의 전자 전달을 촉매하여 박테리아를 분해하는 ROS를 생성합니다. 또한, 세포막의 NADPH 산화효소는 ROS를 세포외로 방출합니다.

이에 대응하여 생물막 박테리아는 ROS를 중화시키는 효소를 생성하고 호중구막에 기공을 형성하고 용해를 일으켜 ROS 생성을 방해하는 류코시딘을 방출합니다. 루미놀은 ROS와 반응하여 여기를 일으키고 이완 시 발광을 방출합니다.

테스트 우물은 대조군에 비해 증가된 ROS 수준을 나타내며, 이는 호중구-옵소나이즈드 생물막 상호 작용을 나타냅니다.

HBSS로 희석된 20% 정상 인간 혈청 100마이크로리터를 세척된 생물막에 적가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 생물막을 옵소니즈합니다. 혈청 용액을 흡인하고 생물막을 150마이크로리터의 HBSS로 적방적으로 세척합니다. HBSS를 흡인하여 옵소화된 생물막이 있는 우물을 남깁니다.

HBSS에 재현탁된 호중구에 루미놀을 첨가하여 최종 농도 5마이크로몰 루미놀을 구성합니다. 이 용액은 그룹 A 및 C에 사용할 준비가 되었습니다. 루미놀과 혼합된 호중구를 옵소니화된 생물막이 있는 웰에 추가합니다.

그룹 D의 경우 호중구가 없는 별도의 튜브에 HBSS에 50마이크로몰 루미놀 용액을 준비하고 생물막이 들어 있는 웰에 첨가합니다. 루미놀과 혼합된 호중구 350마이크로리터를 분취하고 혼합물에 밀리리터당 500나노그램의 최종 농도로 PMA를 첨가합니다.

그룹 B의 경우, 이 혼합물의 호중구를 생물막이 없는 우물에 첨가하십시오. 이것은 양성 대조군 역할을 합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 30초 동안 270RCF에서 원심분리합니다. 플레이트 판독기가 섭씨 37도로 설정되어 있는지 확인하고, 발광 및 키네틱 판독값이 3분 간격으로 60분 동안

플레이트를 플레이트 리더에 넣어 60분 동안 호중구에 의한 ROS 생성을 측정합니다.