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면역학
0 조회수 • 4:41 분 • July 8th, 2025
종양 세포는 이펙터 면역 세포를 활성화하여 사이토카인과 퍼포린과 그란자임을 함유한 세포용해 과립을 방출합니다. 퍼포린은 종양 세포막에 기공을 형성하여 그랜자임이 세포로 들어가는 것을 촉진하고 세포사멸을 시작하여 세포 사멸을 일으킵니다.
담배 제품 준비, TPP, 노출 후 인간 말초 혈액 단핵 세포, PBMC의 세포 용해 기능을 분석하기 위해 TPP 농도가 증가하는 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 배지 함유 우물이 대조군 역할을 합니다.
PBMC 현탁액을 추가합니다. TPP의 주요 면역억제제인 니코틴은 이펙터 PBMC의 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하여 전염증성 사이토카인 생성을 하향 조절합니다.
원심 분리기. TPP 함유 상청액을 제거합니다. PBMC를 배지에 재현탁합니다. 형광 표지된 K562 세포, PBMC 이펙터 세포 세포독성에 대한 감수성이 증가한 인간 백혈병 세포를 웰에 추가합니다.
면역 반응이 억제된 TPP 처리된 이펙터 세포는 감소된 퍼포린 발현 및 사이토카인 방출을 나타내어 PBMC의 세포용해 능력을 감소시킵니다.
원심 분리기. 세포를 완충액에 재현탁한 다음 세포 불투과성 형광 염료를 사용합니다. 염료는 손상된 막과 함께 세포에 들어가 DNA를 염색합니다.
유세포 분석기를 사용하여 웰에서 죽은 K562 세포와 살아있는 K562 세포의 비율을 결정합니다. 대조군보다 TPP 농도가 높은 웰에서 죽은 K562 세포의 비율이 낮다는 것은 TPP 처리된 PBMC에 의한 K562 세포 사멸의 억제를 나타냅니다.
방금 시연한 바와 같이 담배 제품으로 처리된 PBMC 플레이트를 준비한 후, 10밀리리터의 DPBS에서 80% 컨플루언션으로 수확된 K562 세포의 배양물을 세척합니다. 펠릿을 5밀리리터의 DPBS에 재현탁하고 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 1밀리리터의 완전 배지에 1밀리리터의 새로 제조된 CFSE 작업 용액을 1 내지 2 배 10 배 7번째 K562 세포에 첨가하고 소용돌이에 의해 세포 염색을 분산시킵니다.
실온에서 세포를 배양합니다. 정확히 2분 후, 200마이크로리터의 FBS를 첨가하고 세포를 다시 소용돌이치며 2분 더 배양합니다.
두 번째 배양 후, 세포를 10밀리리터의 완전 배지로 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 또 다른 10밀리리터의 완전 배지에 재현탁하고 세포 수를 계산합니다. 이제 담배 처리된 PBMC를 원심분리하고 상청액을 디캔팅합니다. 그런 다음 덮개를 교체하고 소용돌이에 의해 세포를 재현탁한 다음 웰당 200마이크로리터의 완전 배지로 세척합니다.
사멸 분석을 시작하려면 CFSE 표지된 K562 세포를 PBMC에 1 내지 15 비율로 추가하고 섭씨 37도 및 5% CO2에서 공동 배양을 배양합니다.
5시간 후 세포를 회전시키고 상청액을 버립니다. 소용돌이에 의해 펠릿을 재현탁시킨 다음 웰당 200마이크로리터의 러닝 완충액으로 세포를 세척합니다. 그런 다음 95마이크로리터의 러닝 완충액에 이어 5마이크로리터의 7-AAD를 추가하여 웰당 총 부피 100마이크로리터가 됩니다.
마지막으로, 세포를 실온에서 15분 동안 어두운 곳에서 배양한 다음 각 웰에 100마이크로리터의 러닝 버퍼를 추가하고 전체 부피를 적절한 해당 FACS 튜브로 옮겨 유세포 분석을 통해 7-AAD 및 CFSE 양성 세포의 백분율을 결정합니다.