In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

대식세포 배양물이 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 와십시오. 형광 단백질 발현 Listeria monocytogenes, Lm으로 감염됩니다.

Lm의 단백질은 특정 대식세포 수용체에 결합하여 식체 내에서 박테리아를 내재화합니다. 또한 Lm은 식체 막을 파괴하는 기공 형성 독소를 분비하여 박테리아를 세포질로 방출하여 복제하고 숙주 액틴 필라멘트로 둘러싸게 됩니다.

Lm의 액틴 조립 유도 ActA 단백질은 박테리아의 뒤쪽 끝에서 지속적인 액틴 중합을 유도합니다. 생성된 액틴 혜성 꼬리는 세포질을 통해 Lm을 추진하고 대식세포 세포막을 관통하여 중합된 액틴 외피 Lm을 배지로 방출합니다.

배양 후, 웰 세트에서 세포외, 액틴 결합, Lm 함유 배지를 수집하고 고정합니다. 파라포름알데히드를 사용하여 Lm을 고정합니다. 증류수를 첨가하여 대식세포를 파열시키고 세포내 Lm을 방출합니다. 세포내 Lm을 수집하고 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정합니다.

다른 웰에서는 배지를 세포 불투과성 겐타마이신 함유 배지로 교체하여 세포외 Lm을 제거합니다. 새 배지로 교체하고 원하는 기간 동안 배양합니다.

배양 후, 세포외 Lm 함유 배지를 수집하고 샘플을 파라포름알데히드로 고정합니다. 증류수를 사용하여 세포내 Lm을 함유한 용해물을 얻고 샘플을 파라포름알데히드로 고정합니다. 형광 표지된 팔로이딘을 샘플에 첨가하면 중합된 액틴에 선택적으로 결합합니다.

유세포 분석기를 사용하여 샘플에서 Lm 및 액틴 결합 팔로이딘의 형광 신호를 시각화합니다. 감염된 대식세포에서 파생된 세포외 및 세포내 액틴 결합 Lm을 정량화합니다.

자동 세포 계수기를 사용하여 준비된 RAW 264.7 세포를 밀리리터당 1 x 10⁶ 세포의 농도로 조정합니다. 1밀리리터의 샘플을 6웰 조직 배양 플레이트의 웰에 추가합니다. 50의 감염 다수도에 해당하는 준비된 Lm 접종물로 세포를 감염시킵니다.

감염 후 1.5시간 후, 500마이크로리터의 4% PFA로 채워진 1.5mm 미세 원심분리기 튜브에 첫 번째 웰 세트에서 배지를 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포내 Lm을 수집하려면 각 웰에 증류된 멸균수 1밀리리터를 추가합니다. 60초 후, 생성된 물 용해물을 500마이크로리터의 4% PFA가 들어 있는 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 10초 동안 세게 소용돌이치고 얼음 위에 놓습니다.

나머지 웰의 경우 배지를 제거하고 1밀리리터의 DMEM/FCS와 밀리리터당 5마이크로그램의 겐타마이신으로 교체하여 세포외 Lm을 죽입니다. 즉시 접시를 인큐베이터로 되돌립니다.

30분 후 배지를 제거하고 겐타마이신이 없는 DMEM/FCS로 교체합니다. 2-4시간 후, 두 번째와 세 번째 시점 동안 용해물에 담긴 배지를 튜브에 모아 얼음 위에 올려 식힙니다. 튜브를 10,000배 g에서 7분 동안 원심분리합니다.

피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다. 50마이크로리터의 4% PFA와 15마이크로리터의 팔로이딘을 함유한 염색 칵테일을 튜브에 넣고 혼합하여 각 펠릿을 재현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 4도의 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 각 튜브에 FACS 완충액 1밀리리터를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 원심분리기에서 튜브를 10,000배 g으로 7분 동안 회전시킵니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.

즉시 사용하려면 각 펠릿을 400마이크로리터의 FACS 완충액에 현탁시킵니다. 나중에 분석하기 위해 보관하는 경우 200마이크로리터의 FACS 완충액과 200마이크로리터의 4% PFA를 튜브에 넣고 혼합하여 현탁시킵니다.