Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

NOD 유사 수용체 P3 또는 NLRP3, 인플라마좀 활성화를 검출하려면 NLRP3 단백질을 발현하는 활성화된 대식세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 사용합니다.

이오노포어와 글리신을 함유한 배지로 세포를 처리합니다. 이오노포어는 칼륨 이온 유출을 유도하여 NLRP3 단백질을 활성화하고 올리고머화합니다. 올리고머화된 NLRP3는 어댑터 단백질을 모집하여 프로-카스파제-1의 결합을 촉진하여 NLRP3 인플라마좀 복합체를 형성합니다.

인플라마좀에서 근접은 pro-caspase-1 자동 절단을 유발하여 활성 카스파제를 방출하고 파이로토시스 및 핵 응축을 시작합니다. 또한 글리신은 세포 구조를 안정화시켜 세포 용해를 방지합니다.

카스파제-1 결합 그룹과 아미노산 서열을 통해 연결된 형광단을 포함하는 형광 리포터 프로브로 대식세포를 처리합니다. 활성화된 카스파제-1은 프로브의 아미노산 서열을 인식하고 카스파제 결합 그룹에 결합하여 시각화를 가능하게 합니다.

세포를 고정하고 형광 염료로 오버레이하여 핵을 염색합니다. 형광 현미경 아래의 이미지.

NLRP3 인플라마좀 활성화를 시사하는 파란색 응축 핵과 활성화된 카스파제-1의 녹색 형광 병소가 있는 대식세포를 계산합니다.

유리 커버슬립에 파종된 LPS 프라이밍 골수 유래 대식세포의 배지를 웰당 5마이크로몰 니제리신과 5밀리몰 글리신이 보충된 290마이크로리터의 DMEM-5 배지로 교체하는 것으로 시작합니다. 24웰 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 60분 동안 세포 배양 인큐베이터에 되돌리고 처음 15분 후에 10마이크로리터의 30X FAM-YVAD-FMK를 추가합니다.

배양이 끝나면 웰당 1밀리리터의 차가운 PBS로 세포를 세척당 5분 동안 3회 세척하고, 웰당 250마이크로리터의 2% 파라포름알데히드로 세포를 얼음 위에 30분 동안 고정하고, 빛으로부터 보호하고, 마지막 5분 동안 적절한 형광 핵 염료로 세포를 표지합니다.

배양이 끝나면 방금 시연한 대로 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각 슬라이드에 7마이크로리터의 퇴색 방지 마운팅 매체를 로드합니다. 각 슬라이드에 커버슬립을 놓고 커버슬립을 매니큐어로 밀봉하기 전에 밤새 장착 매체가 굳도록 합니다.

형광 공초점 현미경으로 세포를 이미지화하려면 처리되지 않은 대조군 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 수동으로 세포에 초점을 맞춥니다. 현미경 조회 테이블 설정을 사용하여 처리되지 않은 세포에서 양성 프로브 스탠딩이 관찰되지 않을 때까지 오프셋을 조정합니다.

다음으로, 니게리신 처리 샘플을 사용하여 프로브 염색에 대해 양성 및 음성인 세포가 모두 포함된 필드를 찾고 프로브 채널의 이미징 평면을 양성 염색 강도가 가장 높은 평면으로 조정합니다. 그런 다음 응축된 핵이 있는 세포에서 초점이 보일 때까지 게인을 조정하고 총 배율 100배에서 슬라이드당 무작위로 선택된 5개의 필드의 이미지를 얻습니다.