Nigericin 노출 후 대식 세포 사멸을 감지하기 위한 Lactate Dehydrogenase 방출 분석

지질다당류로 프라이밍된 대식세포가 포함된 분석 플레이트를 가져 가십시오.

프라이밍은 비활성 전염증성 사이토카인 전구체 및 NLRP3 단백질의 발현을 증가시킵니다.

칼륨 이오노포어인 니게리신을 첨가하여 이온 유출을 촉진합니다. 이것은 세포 내 칼륨 수치를 방해하여 NLRP3 단백질을 유발하여 큰 복합체를 형성합니다.

올리고머화된 NLRP3는 어댑터 단백질인 ASC를 모집하여 중합을 일으킵니다. ASC 필라멘트는 프로-카스파제-1을 모집하여 다중 단백질 복합체인 NLRP3-인플라마좀을 형성합니다.

Pro-caspase-1은 근접 유도 자동 활성화를 거쳐 caspase-1을 생성합니다. Caspase-1은 전염증성 사이토카인과 gasdermin-D 단백질을 절단하여 원형질막 기공을 생성합니다.

이로 인해 사이토카인 분비 및 염증성 프로그램화된 세포 사멸, 파이로토시스, 젖산 탈수소효소 또는 LDH를 포함한 세포내 내용물이 방출됩니다. LDH 함유 상청액을 수집합니다.

기질 혼합물 - 젖산염, 요오도니트로테트라졸륨 바이올렛 또는 INT 염료, NAD+ 및 디아포라아제를 첨가합니다. LDH는 젖산을 피루브산으로 산화시키면서 NAD+를 감소시킵니다. 디아포라제는 INT의 감소를 촉매하여 빨간색 포르마잔을 형성합니다.

색상 강도는 LDH 방출에 해당하며, 수치가 높아지면 파이로토시스 관련 세포 손상 및 사망이 증가했음을 나타냅니다.

LDH 방출 분석을 수행하려면 10마이크로몰 니제리신이 보충된 DMEM-5 배지 50마이크로리터를 각 실험 웰에 추가하고, 50마이크로리터의 DMEM-5를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 60분 동안 자발적이고 100% 용해 대조군 웰에 추가합니다. 30분 후 100% 용해 대조 웰에 10마이크로리터의 10x 용해 완충액을 추가하고 다른 웰에 10마이크로리터의 배지를 추가합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 원심분리하고 각 웰에서 50마이크로리터의 상청액을 투명하고 평평한 바닥 플레이트로 옮깁니다.

그런 다음 50마이크로리터의 갓 해동되고 준비된 기질을 각 웰에 추가하여 어둠 속에서 30분 동안 배양하고, 15분 후에 플레이트를 확인하여 신호가 플레이트 리더의 검출 한계를 초과하지 않는지 확인합니다. 배양이 끝나면 각 웰에 50마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 적절한 플레이트 리더에서 OD₄₉₀을 측정하여 웰당 세포 용해 비율을 계산할 수 있습니다.