Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

0 조회수4:32 • July 8th, 2025

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형광 표지된 호중구를 포함하는 멀티웰 플레이트로 시작하여 항호중구 세포질 항체를 함유한 환자 혈청으로 치료합니다.

이 항체는 호중구의 Fc 수용체와 상호 작용하여 신호 전달 경로를 활성화하고 활성 산소종 또는 ROS를 생성하며 펩티딜 아르기닌 데이미나제를 활성화합니다.

ROS는 호중구의 탈과립을 일으켜 효소(엘라스타제와 골수과산화효소)를 세포질로 방출합니다. 이러한 효소와 활성화된 펩티딜 아르기닌 데이미나제는 핵으로 이동합니다.

엘라스타제는 히스톤-H1을 절단하고 골수과산화효소는 히스톤을 변형하여 염색질 축합을 시작합니다. 활성화된 펩티딜 아르기닌 데이미나제는 히스톤 시트룰린화를 유도하여 아르기닌 잔기를 시트룰린으로 전환하고 추가 응축 해합에 기여합니다.

축축된 염색질은 항균 및 세포질 단백질을 포함한 세포내 단백질과 혼합됩니다. 나중에 호중구의 막이 붕괴되어 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질이 세포외 공간으로 방출되어 호중구 세포외 트랩인 NET을 형성합니다.

NET의 세포외 DNA에만 독점적으로 결합하는 세포 불투과성 DNA 염료를 추가합니다. 형광 현미경에서 호중구는 녹색 세포외 거미줄과 같은 구조로 빨간색으로 나타나 NET 형성을 확인합니다.

2% FCS를 함유한 페놀 레드 프리 RPMI-1640 배지에서 밀리리터당 420,000개 세포의 밀도로 세포 현탁액을 만듭니다. 검은색 96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 90마이크로리터에 37,500개의 호중구를 추가합니다.

다음으로, 선택한 자극 10마이크로리터를 세 번으로 추가하여 각 웰에서 10%의 농도에 도달합니다. 항상 음성 대조군을 삼중으로 포함하십시오. 섭씨 37도의 어두운 곳에서 원하는 시간(30분에서 2, 4 또는 6시간) 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에서 1마이크로몰의 최종 농도에 도달하기 위해 25마이크로리터의 5마이크로몰 불투과성 DNA 염료를 첨가하는 데 필요한 불투과성 DNA 염료의 부피를 준비합니다.

배양 시간이 끝나기 15분 전에 각 웰에 25마이크로리터의 5마이크로몰 불투과성 DNA 염료를 추가합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 마지막 15분 동안 배양을 계속합니다. 그런 다음 상청액을 매우 조심스럽게 제거하고 필요한 경우 보관하십시오. 100 마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 첨가합니다. 접시를 어둠 속에 보관하고 즉시 다음 섹션으로 진행하십시오.

설정을 구성한 후 Z 시리즈를 선택합니다. 단계 10을 선택합니다. 스텝 크기3마이크로미터를 선택합니다. 플레이트를 면역형광 공초점 현미경에 로드합니다.

실행 탭을 클릭합니다. 플레이트 이름과 설명을 입력하고 보관 위치를 선택합니다. 획득해야 하는 우물을 선택합니다. Texas RedFitC노출 시간을 선택한 다음 Acquire Plate를 클릭하고 획득을 시작하면 플레이트 당 약 1시간이 소요됩니다.

그런 다음 분석 매크로를 선택합니다. 그런 다음 W1을 선택하고 임계값을 선택합니다. 그런 다음 원하는 픽셀 값을 선택하고 마지막으로 두 번째 ImageJ 창에서 W2를 선택하고 원하는 픽셀 값으로 임계값을 선택합니다. 스프레드시트 파일의 대상을 선택합니다. 분석을 실행하고 나중에 로그 파일을 저장합니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026