박테리아 독소의 영향을 연구하기 위한 투과성 멤브레인 삽입 기반 감염 시스템

JoVE Encyclopedia of Experiments

면역학

0 조회수 • 3:28 분 • July 8th, 2025

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투과성 멤브레인 삽입물로 분리된 2개의 챔버 감염 시스템을 가져 가십시오. 하단 구획에는 부착된 인간 각질 세포 또는 피부 세포가 포함되어 있습니다.

상부 챔버에 박테리아 병원체를 추가하고 배양합니다. 막은 병원체가 각질 형성 세포와 직접 접촉하는 것을 방지합니다. 병원체는 세포막을 통과하여 세포에 도달하는 작은 독소인 스트렙톨리신 S 또는 SLS를 분비합니다.

각질 세포의 중탄산나트륨 공동 수송체는 중탄산염과 나트륨 이온의 유입을 매개하여 세포 내 pH를 유지합니다. SLS는 공동 수송체에 결합하여 이온 수송을 방해하여 세포내 삼투압 스트레스를 유발합니다.

스트레스 유도 다운스트림 신호 전달은 격리된 핵 인자-카파 B 또는 NF-κB에 결합된 억제제의 분해를 일으켜 활성화를 유도합니다. 활성화된 NF-κB는 핵으로 전위되어 전염증성 사이토카인 생산의 상향 조절을 유도합니다.

세포외 분비 시 사이토카인은 숙주 세포의 사멸 수용체에 결합하여 괴사를 시작합니다. 배양 후, 배양 상청액을 수확하여 박테리아 독소의 영향을 평가합니다.

치료 직전에 1X PBS를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 약리학적 처리 유무에 관계없이 신선한 성장 배지 2밀리리터를 6웰 플레이트에 도포하거나 0.5밀리리터의 배지를 24웰 플레이트의 웰에 도포합니다. 다음으로, 층류 후드 아래에서 멸균 겸자를 사용하여 멸균 0.4미크론 투과성 멤브레인 삽입물을 각 웰에 조심스럽게 배치합니다.

감염 준비 중에 투과성 인서트를 부드럽고 멸균적으로 취급하는 것은 이 과정에서 멤브레인이 손상되거나 오염되는 것을 방지하는 데 중요합니다.

제조업체의 지침에 따라 각 웰의 상부 챔버에 신선한 세포 배양 배지를 도포합니다. 그런 다음 정규화된 박테리아 배양액을 투과성 멤브레인 삽입 시스템의 상부 챔버에 적절한 양을 적용하고 대조군 웰에 박테리아 배지를 적용합니다.

실험 설정 중에 박테리아가 하부 챔버를 오염시키지 않는 것이 필수적이기 때문에 박테리아를 상부 챔버에 조심스럽게 추가하고 감염된 세포를 인큐베이터로 부드럽게 운반하는 것이 중요합니다.

분비된 숙주 단백질을 평가하려면 멸균 겸자를 사용하여 투과성 멤브레인 삽입물을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 세포의 단층을 방해하지 않으면서 하부 챔버에서 배지를 1.5밀리리터 튜브로 수집합니다.

샘플을 14,000 RCF 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다. 그런 다음 상청액 50마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거하고 신선한 1.5밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026