0 조회수 • 4:15 분 • July 8th, 2025
투과성 막 시스템의 하단 구획에 포유류 숙주 세포를 파종하는 것으로 시작합니다.
스트렙톨리신 S 또는 SLS 독소를 분비하는 것으로 알려진 병원성 박테리아인 연쇄상 구균을 멤브레인 삽입물에 추가합니다. SLS 독소는 막 기공을 통해 확산되어 숙주 세포에 도달합니다.
막 결합 나트륨-중탄산염 공동수송체는 이온 수송을 조절하여 세포 항상성을 유지합니다. 독소는 이러한 공동수송체에 결합하여 이온 수송을 방해하고 숙주 세포에 삼투압 스트레스를 유발합니다.
이는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 경로인 p38 MAPK를 포함한 여러 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 활성화합니다. 활성화된 p38 MAPK는 다운스트림 표적을 인산화하여 박테리아에 대한 세포 반응을 시작합니다.
그런 다음 투과성 멤브레인 인서트를 제거합니다. 숙주 세포 위의 배지를 흡인합니다. 용해 완충액을 첨가하여 세포 내용물을 방출합니다. 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
가용성 용해물 성분을 함유한 상청액과 불용성 용해물 성분을 함유한 펠릿을 수집합니다. 추가 분석을 위해 샘플을 보관하십시오.
치료 직전에 1X PBS를 사용하여 세포를 세척합니다. 그런 다음 약리학적 처리 유무에 관계없이 신선한 성장 배지 2밀리리터를 6웰 플레이트에 도포하거나 0.5밀리리터의 배지를 24웰 플레이트의 웰에 도포합니다. 다음으로, 층류 후드 아래에서 멸균 겸자를 사용하여 멸균 0.4미크론 투과성 멤브레인 삽입물을 각 웰에 조심스럽게 배치합니다.
감염 준비 중에 투과성 인서트를 부드럽고 멸균적으로 취급하는 것은 이 과정에서 멤브레인이 손상되거나 오염되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
제조업체의 지침에 따라 각 웰의 상부 챔버에 신선한 세포 배양 배지를 도포합니다. 그런 다음 정규화된 박테리아 배양액을 투과성 멤브레인 삽입 시스템의 상부 챔버에 적절한 양을 적용하고 박테리아 배지를 대조군 웰에 적용합니다.
실험 설정 중에 박테리아가 하부 챔버를 오염시키지 않는 것이 필수적이기 때문에 박테리아를 상부 챔버에 조심스럽게 추가하고 감염된 세포를 인큐베이터로 부드럽게 운반하는 것이 중요합니다.
멸균 겸자를 사용하여 투과성 멤브레인 인서트를 조심스럽게 제거합니다.
숙주 세포 용해물을 평가하려면 숙주 세포를 방해하지 않고 단층 위의 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 한 번 헹굽니다. PBS를 부드럽게 흡인하고 즉시 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 부피 적용하여 예를 들어 밀리리터당 0.5 내지 1.5 밀리그램의 단백질 농도를 달성합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
다음으로, 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 웰의 플레이트 표면에서 세포를 분리하고 각 웰의 전체 내용물을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 14,000 RCF 및 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.
가용성 용해물 성분을 평가하려면 상청액을 새 튜브로 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오. 핵 또는 기타 불용성 용해물 성분을 평가하려면 펠릿을 예약하여 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.