박테리아에 감염된 세포의 칼슘 반응을 연구하기 위한 이미징 기술

0 조회수3:43 • July 8th, 2025

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세포내 칼슘의 형광 지시약이 로드된 인간 상피 세포의 배양물이 들어 있는 이미징 챔버를 가져 가십시오.

칼슘 이온을 함유한 성장 배지를 추가합니다. 병원성 박테리아인 Shigella를 도입하고 배양합니다.

박테리아 분비 시스템은 숙주 세포에 침투하여 침입 이펙터를 방출합니다. 침입은 액틴 재배열을 유발하여 박테리아 주위에 주름진 막을 형성합니다.

침범 부위에서는 원형질막의 포스포리파제 C 또는 PLC가 활성화되고 이노시톨 삼인산 수용체가 소포체 또는 ER에 클러스터

링됩니다.

PLC는 막 포스파티딜이노시톨 4,5-비인산을 이노시톨 삼인산(IP3)으로 가수분해하며, 이는 조밀한 액틴 그물망으로 인해 국소적으로 축적됩니다.

IP3는 ER의 수용체에 결합하여 칼슘 방출을 유발합니다. 칼슘 지시약은 방출된 이온에 결합하여 형광을 방출하여 국소적인 칼슘 반응을 나타냅니다.

IP3는 액틴을 통해 천천히 확산되어 ER 칼슘 수치를 더욱 고갈시키고 원형질막 칼슘 채널을 활성화하여 칼슘 유입을 유발합니다.

세포 전체의 형광은 지연된 전체 칼슘 반응을 나타냅니다.

Fluo-4 세포가 들어 있는 커버슬립을 이미징 또는 유리 바닥 챔버에 놓습니다. EM 완충액을 사용하여 샘플을 세 번 세척하여 세포 용해로 인해 발생할 수 있는 화합물을 제거합니다. 그런 다음 1밀리리터의 EM 완충액을 추가합니다. 챔버를 섭씨 33도에서 가열된 도립 형광 현미경 스테이지에 놓습니다. 현미경 필드를 선택하고 필요한 경우 노출 시간 및 비닝을 포함한 획득 매개변수를 설정하여 Fluo-4 형광 신호를 최적화합니다.

샘플에 박테리아를 추가하려면 챔버에서 500마이크로리터의 EM 완충액을 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 박테리아 현탁액을 추가하여 0.05의 최종 OD600을 얻습니다. 즉시 수집을 수행하거나 박테리아가 세포에 침전될 때까지 10분 정도 기다리십시오. 획득 스트림이 끝나면 선택한 필드의 위상차 이미지를 획득하여 세포와 접촉하는 박테리아와 박테리아 침입 부위와 관련된 막 주름을 시각화합니다.

이미지 획득 기간, 파일 절약 및 전체 프로세스를 포괄하는 새 필드 선택에 적합한 간격으로 획득 절차를 반복합니다. 획득 절차가 끝나면 칼슘 이오노포어 이오노마이신의 2마이크로몰을 샘플에 추가하여 칼슘 신호의 최대 진폭을 결정합니다. 신호가 안정화될 때까지 일반적으로 3분 미만 동안 5-10초마다 이미지를 획득합니다.

그런 다음 칼슘 킬레이트제 EGTA를 최종 농도 10밀리몰에 첨가하여 칼슘이 없을 때 형광 신호를 결정합니다. 신호가 안정화될 때까지 3-5초마다(일반적으로 10분 미만) 이미지를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026