이미징 유세포 분석을 사용한 인간 T 세포와 SEB 탑재 라지 세포 간의 면역 시냅스 분석

로드되지 않은 Raji 세포와 황색포도상구균 장독소 B 또는 SEB가 로드된 Raji 세포가 포함된 유세포 분석 튜브를 사용합니다.

이러한 SEB가 탑재된 Raji 세포는 클래스 II MHC 분자에 복합화된 초항원 SEB를 포함하는 대리 항원 제시 B 세포로 기능합니다.

범백혈구와 함께 배양합니다.

T 세포의 T 세포 수용체인 TCR은 Raji 세포의 SEB에 결합하며, 이는 공동 자극 신호와 함께 안정적인 세포-세포 접합부인 면역 시냅스를 설정하여 T 세포 활성화를 유도합니다.

이것은 세포 내 신호 전달 경로를 유발하여 시냅스 내에서 신호 분자와 표면 수용체의 클러스터링과 함께 액틴 세포골격 재배열을 유발합니다.

배양 후 세포를 고정하여 세포 구조를 보존합니다. 세포를 투과시켜 세포내 표적에 접근합니다.

형광단 표지 항-CD3 항체, 팔로이딘 및 DAPI를 추가하는데, 이는 각각 TCR 복합체, 액틴 필라멘트 및 DNA에서 CD3에 결합합니다.

이미징 유세포 분석기를 사용하여 CD3 및 액틴의 형광 신호를 시각화하여 SEB가 있는 시냅스에서 농축을 결정합니다.

50밀리리터 원뿔형 튜브에 새로 채취한 인간 말초 혈액 1밀리리터와 ACK 용해 완충액 30밀리리터를 혼합하는 것으로 시작합니다. 실온에서 8분 후, 원심분리 세척을 위해 튜브에 PBS를 채우고 펠릿을 2밀리리터의 배양 배지에 재현탁하여 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 500마이크로리터의 배양 배지에 5 x 10⁵ 황색포도상구균 장독소 B 또는 SEB가 로드되거나 언로드된 Raji 세포를 개별 FACS 튜브에 추가한 다음 650마이크로리터의 범백혈구를 추가합니다. 공동 배양액을 스핀다운하고 펠릿을 150마이크로리터의 신선한 배양 배지에 재현탁하여 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다.

그런 다음 1.5% 파라포름알데히드 1.5밀리리터를 첨가하면서 100RPM에서 10초 동안 세포를 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 실온에서 10분 후, 1% BSA를 보충한 PBS 1밀리리터로 고정을 중단하고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다. 펠릿을 100마이크로리터의 PBS와 BSA 및 0.1% 사포닌에 재현탁하고 세포 샘플을 96웰 U-바닥 플레이트의 두 개별 웰에 추가합니다.

실온에서 15분 후, 플레이트를 원심분리하고 펠릿을 50마이크로리터의 PBS와 BSA 및 사포닌에 재현탁하고, 형광단 접합 항체 또는 관심 화합물을 함유하여 실온에서 어