Electroporation에 의하여 포유류 세포로 Bacterial Effector 단백질의 소개

특정 그람 음성 박테리아 병원체는 숙주 세포와 접촉하고 분비 시스템을 사용하여 이펙터 단백질을 주입하여 세포 침입을 촉진합니다.

시험관 내에서 포유류 세포에 이펙터 단백질을 전달하려면 포유류 세포를 식힌 큐벳에 피펫팅합니다. 스트렙타비딘 결합 펩타이드 태그가 부착된 박테리아 이펙터 단백질을 첨가하고 혼합합니다.

전기천공을 수행합니다. 실행 중에 짧은 전기 펄스는 숙주 세포막 지질 이중층을 파괴하여 일시적인 기공을 형성하여 이펙터 단백질의 세포 진입을 촉진합니다. 배지가 들어 있는 유리판에 세포를 도금하여 세포가 회복되어 플레이트에 부착되도록 합니다. 모공이 다시 밀봉되어 내부의 단백질을 가둡니다.

세포 회수 후, 세포 내 표적에 대한 항체 접근을 위해 세포를 고정하고 투과화합니다. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 단백질 함유 차단 용액과 함께 배양합니다. 세포내 이펙터 단백질의 스트렙타비딘 결합 펩타이드 태그에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 추가합니다.

시각화를 위해 이펙터 단백질에 결합된 1차 항체에 결합하는 형광단 태그 2차 항체를 도입합니다. 형광단 접합 밀 배아 응집소 및 DAPI를 첨가하여 각각 세포막 당단백질 및 DNA를 염색합니다.

공초점 현미경을 사용하여 이펙터 단백질, 세포막 및 DNA의 형광 신호를 시각화합니다.

성공적으로 전기천공된 세포는 이펙터 단백질로부터 상당한 세포내 형광 신호를 나타내며, 이는 세포내 국소화를 시사합니다.

이 절차를 시작하려면 400마이크로리터의 세포 현탁액을 미리 냉각된 큐벳에 옮긴 다음 선택한 단백질 20마이크로그램을 첨가하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도에 도달합니다. 큐벳을 약 10회 부드럽게 넘겨 혼합하고 세포가 손상되지 않도록 합니다. 그런 다음 전기천공기의 전기 아크를 방지하기 위해 종이 타월로 큐벳 외부를 말리십시오.

샘플을 전기천공기에 넣고 1.5-1.7밀리초 동안 0.3킬로볼트로 설정합니다. 전기천공 직후 큐벳을 약 10회 부드럽게 넘겨 샘플을 완전히 혼합한 후 고정 및 면역형광 염색 또는 친화성 정제를 진행합니다.

전기천공에서 4시간 동안 회복한 후, 멸균 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 실온에서 2분 동안 100% 메탄올에 세포를 고정합니다. 그런 다음 멸균 PBS로 세포를 세 번 더 세척합니다. PBS에서 0.4% Triton X-100으로 세포를 15분 동안 투과화합니다. 표적 단백질의 에피토프와 위치에 따라 투과화 길이와 Triton X-100의 강도를 조정합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 PBS에서 5% BSA로 세포를 차단합니다.

그런 다음 PBS로 세 번 세척하십시오. 다음으로, 항체 결합 용액에 있는 1차 항체와 함께 섭씨 4도에서 밤새 부드럽게 흔들면서 배양합니다.

다음날 PBS로 세포를 4회 더 세척합니다. 그런 다음 항체 결합 용액에서 적절한 형광 접합 2차 항체와 함께 배양합니다. 필요에 따라 5마이크로몰 밀 배아 응집소(WGA)과 같은 다른 염색제를 실온에서 1시간 동안 Alexa 647 또는 DAPI에 접합시키고 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 세포를 PBS로 5회 세척하고 이미징할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호하여 섭씨 4도에서 보관합니다.