숙주 상피 세포에 대한 박테리아 부착에서 Vitronectin의 역할을 연구하기 위한 분석

부착된 상피 세포 단층을 포함하는 멀티웰 플레이트를 가져 와십시오. 배지를 무혈청 배지로 교체하여 혈청 단백질 간섭을 방지합니다. 배양 후 배지를 제거합니다. 완충액으로 세포를 세척하십시오. 비트로넥틴이 함유된 냉장 무혈청 배지를 추가합니다. 더 낮은 온도에서 배양하십시오.

비트로넥틴의 N-말단 RGD 도메인은 상피 세포 표면 인테그린 수용체에 결합합니다. 온도가 낮을수록 비트로넥틴-인테그린 복합체의 세포 내재화가 억제됩니다.

인테그린 수용체 포화 후 배지를 제거합니다. 박테리아 비트로넥틴 의존성 인테그린 결합에 영향을 미칠 수 있는 과도한 비트로넥틴을 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.

헤모필루스 인플루엔자 f형 또는 그람 음성 세균 병원균인 Hif, 현탁액을 첨가합니다. 인큐베이트.

Hif 표면의 단백질 H는 비트로넥틴의 C-말단에 결합하여 Hif 상피 세포 부착 및 후속 내재화를 촉진합니다.

배지를 제거하고 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 Hif를 제거합니다. 세포 분리 효소를 사용하여 세포를 수확합니다. 효소 반응을 멈추기 위해 혈청 함유 배지를 첨가하십시오. 세포 현탁액을 유리 구슬이 들어 있는 유리관으로 옮깁니다. 소용돌이를 통해 세포를 용해하여 내재화되고 표면에 부착된 박테리아를 방출합니다.

초콜릿 한천 접시에 무혈청 배지와 씨앗으로 용해물을 희석합니다. Hif가 식민지를 형성하도록 배양합니다. 식민지를 세어보세요.

더 많은 수의 콜로니는 비트로넥틴의 존재 하에서 상피 세포에 대한 Hif 부착이 향상되었음을 나타냅니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 A549 상피 세포를 배양합니다. 섭씨 37도에서 세포를 1회 세척하고 트립신화한 후, 겐타마이신 밀리리터당 5마이크로그램을 함유하는 완전 배지를 사용하여 세포 현탁액을 밀리리터당 5,000개 세포로 희석합니다.

박테리아 감염 전에 웰의 배지를 F12 배지로 교체하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 실온에서 1밀리리터의 PBS로 세포 단층을 세 번 세척합니다. 그런 다음 접시를 얼음 위에 놓고 비트로넥틴 밀리리터당 10마이크로그램을 포함하는 사전 냉각된 F12 배지 200마이크로리터를 추가합니다.

플레이트를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한 후 피펫팅으로 용액을 버리고 실온에서 PBS 1밀리리터로 세포층을 2회 세척합니다. F12 배지에 새로 재배된 Hif 야생형 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양