생체 외 조건에서 HIV 발병기전을 연구하기 위한 인간 자궁경부 점막 감염 모델

자궁경부 자궁 점막을 페트리 접시에 넣습니다. 점막하층에서 외경부 및 자궁경부 점막을 분리합니다. 점막층을 더 작은 외식편으로 자르고 원추형 튜브로 옮깁니다.

인간 면역결핍 바이러스 1형 또는 HIV-1을 외식체 튜브에 추가합니다. HIV-1 바이러스 입자는 노출된 점막층에 접근하여 숙주 세포의 CD4 수용체 및 CXCR4 보조 수용체에 결합합니다.

결합 시 바이러스 외피는 숙주 세포막과 융합되어 바이러스 RNA와 역전사 효소를 포함하는 바이러스 캡시드를 세포질로 방출합니다. 세포질 내부에서 역전사 효소는 바이러스 RNA를 상보적 DNA 또는 cDNA로 전환합니다.

cDNA는 숙주 세포 핵으로 이동하며, 여기서 인테그라제는 바이러스 DNA를 숙주 게놈에 통합합니다. 바이러스 DNA는 새로운 바이러스 입자로 조립되는 새로운 바이러스 RNA와 단백질의 합성을 지시합니다. 이 입자는 숙주 세포에서 싹을 틔워 지질 외피를 얻습니다.

결합되지 않은 바이러스를 제거하기 위해 적절한 완충액으로 외식편을 헹굽니다. 마지막으로, 적절한 배지가 있는 멀티웰 플레이트의 젤라틴 스펀지에 외식편을 놓고 배양합니다.

공기-액체 인터페이스는 스펀지 모세관을 통한 산소 노출과 영양분 접근성을 극대화하여 다운스트림 분석을 위한 모델 실행 가능성을 향상시킵니다.

페트리 접시의 뚜껑을 절단면으로 사용하여 조직을 해부합니다. 겸자로 조직을 부드럽게 잡고 메스와 칼날로 간질 및 점막하층에서 외경부 및/또는 자궁경부의 점막을 분리하여 점막 스트립을 얻습니다. 점막을 2mm 너비의 스트립으로 자릅니다. 가능한 한 많은 점막하층을 제거하고 폐기하고 2mm 두께의 조직층만 남깁니다. 그런 다음 스트립을 2mm 두께의 블록으로 자릅니다.

해부를 진행하는 동안 조직 건조를 방지하기 위해 10-20밀리리터의 CMT가 들어 있는 새로운 100mm 페트리 접시로 조직 외식편을 옮깁니다. 해부가 끝나면 플레이트를 소용돌이치게 하여 외식편 분포를 무작위화합니다. 멸균 겸자를 사용하여 외식편을 멸균 1.5밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 피펫을 사용하여 튜브의 배지를 제거합니다.

최적의 결과를 얻으려면 자궁경부 외식편은 수술 후 가능한 한 빨리, 이상적으로는 수술 당일에 처리하고 감염시켜야 합니다. 또는 조직을 밤새 4도의 CMT에 담근 상태로 보관하고 해부 직후 감염시킬 수 있습니다.

HIV-1 제제를 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다. 해동되면 바이러스를 외식편이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 열 셰이커로 옮기고 섭씨 37도에서 300RPM으로 흔들어 2시간 동안 배양합니다. 30-60분마다 몇 번 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.

한편, 웰당 3-4밀리리터의 멸균 인산염 완충 식염수로 6웰 플레이트를 채웁니다. HIV-1과의 배양이 끝나면 피펫을 사용하여 외식편이 들어 있는 튜브에 있는 모든 바이러스 제제를 소독액이 담긴 용기에 버립니다. 그런 다음 집게와 피펫을 사용하여 외식편을 PBS가 포함된 6웰 플레이트로 옮깁니다.

외식편을 실온에서 1분 동안 PBS에 그대로 둔 후 PBS를 웰에 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세척합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 PBS를 소독액이 담긴 용기에 버립니다. 각 웰에 3-4밀리리터의 새로운 PBS를 추가합니다. 총 세 번의 세탁에 대해 두 번 더 반복합니다. 조직 건조를 피하기 위해 외식편을 스폰지로 옮기기 직전에 PBS를 폐기하십시오.

이제 집게를 사용하여 각 젤라틴 스펀지 위에 있는 5-8개의 외식편을 12웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.