Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay를 사용한 Bioactive Type-I 인터페론의 정량화

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테스트 샘플에서 인터페론-알파 및 인터페론-베타와 같은 생리 활성 I형 인터페론을 정량화하려면 조작된 리포터 세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 채취합니다. 이 세포는 인터페론-알파 및 베타 유도 프로모터의 제어 하에 분비된 배아 알칼리성 포스파타제, SEAP, 리포터 유전자를 발현합니다.

알 수 없는 I형 인터페론 농도를 포함하는 테스트 샘플을 추가합니다. 다양한 인간 I형 인터페론 농도를 표준 대조군 역할을 하는 다른 우물로 피펫팅합니다. 인큐베이트.

테스트 웰의 I형 인터페론은 특정 세포 표면 수용체에 결합하여 야누스 키나아제를 활성화합니다. 이러한 단백질 키나아제는 신호 변환기 및 전사 활성화제, STAT, 단백질을 인산화하여 특정 인터페론 조절 인자와 복합체를 형성합니다.

핵에 들어가면 복합체는 인터페론-알파 및 베타 유도 프로모터의 특정 DNA 서열에 결합하여 SEAP 유전자 전사를 활성화하고 배지로 분비되는 SEAP 효소를 생성합니다.

SEAP 함유 배지를 SEAP 특이적 기질이 있는 멀티웰 플레이트 웰로 옮깁니다. SEAP는 분홍색 기질을 가수분해하여 보라색-파란색 제품을 생성합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 SEAP 수준 및 Type-I 인터페론 농도를 나타내는 테스트 및 표준 웰에서 제품의 흡광도를 측정합니다.

표시된 표준 I형 인터페론 곡선에서 테스트 샘플의 생리 활성 I형 인터페론 농도를 결정합니다.

HEK-Blue 인터페론-알파/베타 리포터 세포를 사용하여 생리 활성 I형 인터페론을 측정하려면 먼저 리포터 세포를 96웰 평평한 바닥 플레이트에서 웰당 50,000개의 밀도로 최종 부피 180마이크로리터로 도금합니다. 그런 다음 방금 수확한 공동 배양 상청액 20마이크로리터를 각 웰에 이중으로 추가합니다. 일련의 내부 표준 대조군을 포함하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 18-22시간 동안 배양합니다.

리포터 세포에서 방출되는 알칼리성 포스파타제의 수준을 결정하려면 새로운 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 180마이크로리터의 QUANTI-Blue 용액을 추가합니다. 그런 다음 유도된 HEK-블루 인터페론-알파/베타 세포 상청액 20마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 표준 인터페론 대조군 웰에서 색상이 나타날 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다.

QUANTI-Blue 용액은 효소가 있을 때 분홍색에서 보라색-파란색으로 변합니다. 마지막으로, 분광 광도계를 사용하여 620 내지 655 나노미터에서 분비된 알칼리성 포스파타제의 수준을 평가하고 인터페론 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽하여 I형 인터페론의 농도를 결정합니다.

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Last updated: 18 July 2026