염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

염증을 유도하기 위해 지질다당류를 복강 내 주사한 마취된 마우스로 시작합니다.

노출시키기 위해 복부를 절개합니다. 식염수로 장기 수분 공급을 유지하십시오. 로다민 6G를 안와 후로 주입합니다. 형광 염료 분자는 순환계에 들어가 시각화를 위해 백혈구와 혈소판에 라벨을 붙입니다.

이제 장간막 혈관으로 회장 고리를 외부화합니다. 최적의 이미징을 위해 미리 데운 식염수로 조직에 수분을 공급하십시오. 형광 현미경으로 생체 내 현미경 검사를 위해 장간막 정맥에 초점을 맞춥니다.

지질다당류 주사는 셀렉틴을 포함한 접착 분자의 상향 조절과 함께 내피 세포 활성화를 유발합니다. 순환하는 혈소판은 내피로 모집되어 특정 접착 분자-리간드 상호 작용을 통해 결합하여 접착 복합체를 형성합니다.

이러한 상호 작용으로 인해 혈소판이 활성화되고 세로토닌을 포함한 분자를 함유한 과립이 방출되어 백혈구 모집이 촉진됩니다.

백혈구는 내피 표면으로 이동하여 활성화된 혈소판에 결합합니다. 또한, 백혈구는 내피를 따라 굴러가며 약한 접착 상호 작용을 통해 내피 세포에 결합합니다. 롤링 동작은 백혈구-내피 전도에 중요한 내피 세포에 대한 확고한 접착을 위해 백혈구 인테그린을 활성화합니다.

생체 내 현미경을 사용하여 형광 백혈구와 혈소판을 시각화하여 내피 세포와의 실시간 상호 작용을 결정합니다.

생체 내 이미징 4시간 전에 16-20g의 4-6주 된 수컷 마우스에 LPS IP 킬로그램당 20mg을 주입하여 모의 박테리아 염증 반응을 유도합니다.

때도 플라스틱 챔버와 장간막 조직을 가습하기 위해 섭씨 37도 수조에서 0.9% 식염수를 예열합니다. 다음으로, LPS 처리한 마우스의 발가락 꼬집기에 대한 반응 부족으로 적절한 마취 깊이를 확인한 후 동물의 눈에 연고를 도포한다.

면도기로 복부를 제모하고 70% 에탄올에 적신 거즈로 느슨한 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 작은 구부러진 집게와 가위를 사용하여 복부를 엽니다.

상복부 혈관을 식별하고 백선 영역의 복막을 열어 혈관을 보호합니다. 예열된 식염수 몇 방울을 복강에 떨어뜨려 조직을 촉촉하게 유지한 다음 50마이크로리터의 로다민 6G를 안와후 주사하여 순환 혈액 세포를 표시합니다. 그런 다음 마우스를 10cm 페트리 접시에 넣고 회장 루프를 외부에 배치하고 격분마다 예열된 식염수를 투여하여 조직을 촉촉하게 유지합니다.

생체 내 현미경으로 염증 반응을 시각화하려면 마우스를 현미경 아래에 놓고 직경이 200-300마이크로미터이고 가능한 한 눈에 보이는 주변 지방을 가진 장간막 정맥을 시야로 가져옵니다.

적절한 현미경 소프트웨어를 사용하여 마우스당 4개의 서로 다른 정맥에서 1분 동안 혈액 세포-내피 상호 작용을 기록합니다. 그런 다음 세포 간 반응을 분석하기 위해 안정적이고 개인 간 혈류 상태를 확인합니다.

구르는 백혈구의 수를 정량화하려면 정맥을 통해 수직선을 그리고 1분 안에 이 선을 가로지르는 모든 백혈구를 수동으로 계산합니다. 롤링 속도를 결정하려면 정맥을 통해 50마이크로미터 간격으로 두 개의 수직선을 그리고 내피에서 안정적으로 굴러가면서 단일 백혈구가 선 사이를 교차하는 데 걸리는 시간을 측정합니다.

백혈구 유착을 측정하려면 정맥에 200 x 200 마이크로미터의 정사각형을 그립니다. 그런 다음 30초 동안 정사각형 내에서 눈에 보이는 움직임을 보이지 않는 단단히 부착된 백혈구를 수동으로 계산합니다. 마지막으로, 혈소판-백혈구 상호작용을 정량화하기 위해 하나의 백혈구에 결합된 혈소판의 수를 수동으로 계산합니다.