곤충 유충에서 루시페라아제를 발현하는 박테리아의 생체 내 부담 측정(Measurement of the In vivo Burden of Bacteria Expressing Luciferase in an Insect Larva)

생체 내 박테리아 부하를 측정하려면 Bacillus Calmette-Guérin 또는 BCG lux에 사전 감염된 멸균된 곤충 유충으로 시작합니다. BCG lux는 생물발광 생성 효소인 루시페라아제를 발현하는 유전자 변형 소균 BCG 균주입니다.

곤충 유충을 강철 볼이 있는 완충액 함유 용해 매트릭스 튜브로 옮깁니다. 균질화기를 사용하여 유충을 균질화하여 박테리아를 포함한 세포내 성분을 완충액으로 방출합니다.

튜브를 원심분리하여 균질을 수집하고 이를 발광계 튜브로 옮깁니다.

세제 함유 완충액으로 매트릭스 튜브를 세척하여 세포 조각을 가용화하고 잔류 박테리아를 방출합니다.

동일한 발광계 튜브에 분획을 결합하고 루시페라아제 기질을 추가합니다. 기질은 박테리아에 들어가 루시페라아제 효소와 상호 작용하여 생물 발광을 일으킵니다. 튜브를 발광계에 넣고 생물 발광을 측정합니다.

발광계는 방출된 빛의 강도를 측정하고 곤충 유충에서 BCG의 생체 내 부담을 나타내는 상대 광 단위(RLU)를 계산합니다.

희석된 균질염 현탁액을 피페라실린 함유 한천 플레이트에 펴고 배양하여 BCG를 별개의 콜로니로 선택적으로 성장시킵니다. 플레이트의 콜로니는 콜로니 형성 단위 또는 CFU를 나타냅니다. RLU 대 CFU 비율은 생물발광과 박테리아 생존력의 상관관계가 있습니다.

24시간마다 감염된 유충 5마리를 무작위로 선택하고 70% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 유충 표면을 부드럽게 살균합니다. 유충을 800마이크로리터의 멸균 PBS가 들어 있는 2밀리리터 용해 매트릭스 튜브에 개별적으로 넣습니다. 그런 다음 균질화기를 사용하여 초당 6미터로 60초 동안 유충을 균질화합니다.

용해 튜브를 3,500배 g에서 5초 동안 원심분리하여 뚜껑에서 균질액을 제거하고 균질액을 5개의 멸균 발광계 튜브에 개별적으로 조심스럽게 디캔팅합니다. 멸균 1.5밀리리터 반응 튜브에 100마이크로리터의 균질염을 보관합니다. 용해 매트릭스 튜브를 1밀리리터의 PBST로 세척하여 남아 있는 균질액을 회수하고 해당 발광계 튜브에 피펫을 넣습니다.

발광계 튜브를 소용돌이치고 발광계에서 균질의 생물 발광을 측정합니다. 그런 다음 PBST를 사용하여 24웰 배양 플레이트에서 예약된 100마이크로리터의 균질염의 10배 연속 희석액을 준비합니다. 희석액 10마이크로리터를 각 Middlebrook 7H11 한천 플레이트에 피펫팅하고 멸균 플레이트 스프레더를 사용하여 퍼뜨립니다. 섭씨 37도에서 2주 동안 배양합니다.

그런

다음 식민지 형성 단위를 계산합니다.