유세포 분석을 사용한 요로병원성 대장균 감염 마우스 방광 조직의 면역 세포 침투 정량화

0 조회수3:43 • July 8th, 2025

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요로 병원성 대장균에 감염된 마우스 방광 조직에서 면역 세포 침윤을 정량화하려면 다진 조직을 콜라게나제와 데옥시리보뉴클레아제가 포함된 소화 완충액에 넣습니다.

조직을 파괴하기 위해 정기적으로 흔들면서 배양하십시오.

콜라게나제는 조직의 세포외 기질을 소화하여 세포를 방출합니다. 데옥시리보뉴클레아제는 간섭하는 유리 DNA를 분해합니다.

배양 후, 킬레이트제와 태아 소 혈청이 포함된 완충액을 첨가하여 소화 효소를 비활성화합니다.

소화된 혼합물을 스트레이너에 통과시켜 조직 파편과 결합 조직을 제거하고 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

세포

를 원심분리하고 Fc-차단 항체가 포함된 완충액에 재현탁합니다. 이 항체는 면역 세포 Fc 수용체에 결합하여 비특이적 항체 결합을 방지합니다.

면역 세포의 막관통 CD45 단백질에 결합하는 형광단 태그가 있는 항-CD45 항체를 추가합니다.

심분리하고 재현탁된 세포를 세포 여과기를 통해 통과시켜 세포 응집체를 제거합니다.

유세포 분석기를 사용하여 면역 세포에 대한 형광단 접합 항체의 형광 신호를 측정하여 방광의 면역 세포 침윤을 정량화합니다.

방광 조직에 대한 유세포 분석을 수행하려면 시연된 대로 방광을 분리한 후 가위를 사용하여 조직을 잘 다집니다. 소화 완충액이 들어 있는 튜브당 다진 방광 1개를 넣은 다음 튜브를 흔들어 소화 완충액에서 다진 조직을 세척하고 모든 방광이 해부되고 다질 때까지 얼음 위에 보관합니다. 다진 방광을 섭씨 37도에서 60-75분 동안 배양하고 15분마다 손으로 5초 동안 세게 흔듭니다.

티슈가 젖은 티슈 페이퍼와 유사한 유리처럼 투명한 모양을 갖으면 소화가 완료된 것입니다. 얼음처럼 차가운 유세포 분석 완충액 2-3밀리리터를 첨가하여 소화 효소를 비활성화하고 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

단일 세포 현탁액을 보장하고 결합 조직을 제거하려면 15밀리리터 원뿔형 튜브에 배치된 100마이크로미터 필터를 통해 튜브의 내용물을 통과시킵니다. 그런 다음 주사기 플런저 끝으로 필터를 통해 남아 있는 조직을 부드럽게 누릅니다. 추가 2밀리리터의 유세포 분석 완충액으로 필터를 세척하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 시료를 섭씨 4도에서 200배g에서 7분 동안 원 심분리하여 세척합니다.

밀리리터당 5마이크로그램으로 희석된 Fc 블록을 포함하는 100마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 펠릿을 재현탁하고 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮깁니다. 10-15분 후, 각 샘플에 100마이크로리터의 원하는 항체 칵테일을 추가합니다. 그런 다음 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 샘플을 30-45분 동안 배양합니다. 시료를 섭씨 4도에서 200배 g으로 7분 동안 원심분리하여 세척합니다.

마지막으로, 세포 펠릿을 200마이크로리터의 유세포 분석 완충액에 재현탁하고, 유세포 분석기에서 획득하기 직전에 5밀리리터 폴리스티렌 튜브의 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 샘플을 통과시킵니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026