동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

숙주 면역 체계를 억제하기 위해 이전에 조사된 마취된 수혜자 마우스로 시작합니다.

동종 줄기 세포 이식을 모방하기 위해 유전적으로 다른 기증자 마우스로부터 조혈 줄기 세포를 얻습니다.

마그네틱 비드를 사용하여 기증자 T 세포를 제거합니다.

이 T 세포 고갈된 현탁액을 수혜자 마우스의 안구후 공간에 주입합니다.

이식된 세포는 혈류로 들어가 골수 혈관으로 이동하고 접착 분자를 사용하여 틈새로 들어가 조혈을 시작합니다.

동종 기증자 마우스의 비장 T 림프구를 수혜자의 안구후 공간에 주입하여 면역 교차 반응성을 유도합니다.

이러한 동종 반응성 T 세포는 다양한 조직으로 이동합니다.

T 세포 표면 수용체는 수용자 세포 항원에 결합하여 이를 이물질로 인식합니다.

이는 T 림프구 내에서 일련의 신호 전달 이벤트를 유발하여 활성화로 이어집니다.

활성화된 T 세포는 숙주 조직을 집단적으로 손상시키는 추가 면역 세포의 모집을 특징으로 하는 염증 캐스케이드를 유발하여 이식편대숙주병의 발병으로 이어집니다.

수혜자 BALB/c 마우스의 전신 조사 1일 후, CD45.1/Ly5.1 B6을 배치합니다. SJL 기증자 마우스를 깨끗한 작업 칼집 위에 엎드린 자세로 만들고 Semken 집게의 13cm 구부러진 톱니 모양 끝 하나를 사용하여 한쪽 아킬레스건에서 털을 들어 올립니다.

끝이 곧은 8.5cm 가는 가위를 사용하여 집게와 한쪽 발뒤꿈치 사이의 피부를 절개하고 절개 부위를 두개골로 늘려 뒷다리의 피부와 털을 쉽게 제거합니다. 뒷다리에서 피부를 제거한 후 각 엉덩이, 발목 및 무릎 관절을 절단합니다.

모든 뒷다리의 허벅지와 정강이를 얼음 위의 PBS로 채워진 단일 92mm 페트리 접시에 보관하고 각 뼈에서 가능한 한 많은 근육을 조심스럽게 제거하고 청소된 각 대퇴골과 경골을 젖은 얼음 위의 멸균 RPMI 1640 배지의 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.

골수를 분리하려면 신선한 RPMI 1640 배지로 채워진 새로운 92mm 페트리 접시에 한 번에 하나의 뼈를 옮기고 메스를 사용하여 각 뼈의 끝을 잘라냅니다. 다음으로, 26게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 한 번에 1밀리리터의 신선한 배지로 뼈를 5밀리리터의 배지가 들어 있는 50밀리리터 수집 튜브에

모든 뼈를 씻어내면 부서지기 쉬운 골수 조각을 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 40마이크로미터 메쉬 스크린 세포 스트레이너를 통해 세포를 새로운 50밀리리터 수집 튜브로 여과하기 전에 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 실온에서 3분 동안 배양하기 위해 5밀리리터의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다. 배양이 끝나면 PBS 10밀리리터로 반응을 멈추고 세포를 다시 원심분리합니다.

계수를 위해 펠릿을 2밀리리터의 신선한 PBS에 재현탁하고 다운스트림 유세포 분석을 위해 6 x 10⁶ 세포 분취량을 따로 보관합니다. 다음으로, 시중에서 판매되는 세포 정제 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 골수 단일 세포 현탁액에서 CD90.2 양성 T 세포를 자기적으로 고갈시키고, 분리 전후의 세포 순도 및 조성에 대한 다운스트림 유세포 분석을 위해 T 세포 고갈 용출액의 1 x 10⁶ 세포 분취량을 따로 보관합니다.

그런 다음 30게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 5 x 10 5 T 세포 고갈된 골수 세포와 100마이크로리터의 PBS를 조사된 각 수혜자의 정맥동의 안구후궁에 정맥 주사합니다.

다음날 기증자 동물로부터 채취한 비장을 50밀리리터 수집 튜브의 40마이크로미터 메쉬 스트레이너에 놓고 주사기 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 비장 조직을 튜브로 누릅니다. 여과기와 플런저를 PBS로 세척하여 모든 비장세포를 수집하고, 시연된 대로 적혈구 용해 후 원심분리에 의해 세포를 펠릿화합니다. 계수를 위해 백혈구를 재현탁하고 다운스트림 유세포 분석을 위해 6 x 10⁶ 세포 분취량을 따로 보관합니다.

총 비장세포에서 총 CD3 양성 T 세포를 분리하려면 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 세포 정제 키트를 사용하고 분리 전후에 세포 순도 및 구성의 다운스트림 유세포 분석을 위해 양성 세포 분획에서 1 x 10⁶ CD3 양성 T 세포 분취량을 따로 보관합니다. 그런 다음 7 x 10⁵ 동종반응성 CD3 양성 T 세포와 100마이크로리터의 PBS를 각 수용자 마우스의 안구후 공간에 정맥 주사하여 GvHD를 유도합니다.