0 조회수 • 3:56 분 • July 8th, 2025
관통 수용체인 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드 또는 NTCP(막관통 수용체)를 발현하도록 유전자 변형된 인간 간암 세포 배양물을 예로 들어 보겠습니다.
재조합 B형 간염 바이러스(HBV)를 추가합니다. 바이러스는 표면 단백질을 포함하는 외부 외피와 게놈을 둘러싸는 내부 뉴클레오캡시드로 구성됩니다. 루시페라아제 리포터 유전자를 삽입하면 바이러스의 번식 능력이 억제됩니다.
바이러스 외피 단백질은 숙주 세포의 NTCP 수용체에 결합합니다.
NTCP는 표피 성장 인자 수용체인 EGFR과 상호 작용하고 올리고머화하여 바이러스의 EGFR 매개 엔도사이토시스를 유도합니다.
바이러스 외피는 엔도좀 막과 융합하여 핵 기공 복합체에서 분해되는 뉴클레오캡시드를 방출합니다.
바이러스 게놈은 핵에 들어가 루시페라아제를 포함한 바이러스 단백질을 암호화하는 공유 폐쇄 원형 DNA 또는 cccDNA(안정적인 주형)로 전환됩니다.
미리 정의된 간격으로 세포를 수확하고 용해하여 세포내 루시페라아제를 방출합니다.
기자 기판을 도입합니다. 루시페라제는 기질을 산화시켜 신호를 생성합니다.
감염 후 루시페라아제 활성의 증가는 바이러스 게놈의 지속적인 발현을 나타냅니다.
HBV 감염에 취약한 타우로콜산나트륨, 공동수송 폴리펩티드 또는 NTCP를 안정적으로 발현하는 HepG2 세포를 플레이트하고 섭씨 37도 및 5% CO2에서 배양합니다.
감염 하루 전, 약 5 x 104 HepG2/NTCP 세포를 0.1밀리리터의 배양 배지에 96웰 콜라겐 코팅 플레이트의 웰에 도금합니다. 재조합 HPV를 섭씨 37도 수조에서 바이알에 약간의 얼음이 남을 때까지 해동합니다.
78마이크로리터의 신선한 배양 배지, 2마이크로리터의 DMSO, 1X PBS에 40% PEG8000 10마이크로리터, 10마이크로리터의 재조합 HPV를 결합하여 감염용 배지를 준비합니다. 100웰 플레이트의 각 웰에 96마이크로리터의 재조합 HBV 용액을 추가합니다.
감염 후 하루 후 300마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척하여 바이러스 분획에서 오염된 리포터 단백질을 제거합니다. 2% DMSO를 함유한 배양 배지 200마이크로리터를 감염된 세포에 첨가하고 1주일 이하 동안 배양합니다.
HBV 감염 분석을 수행하려면 감염 1주일 후 PBS를 사용하여 감염된 세포를 3회 세척합니다. 감염된 세포에 50마이크로리터의 용해 완충액을 첨가합니다. 배양판을 5분 동안 흔든 후 2000배g에서 5분 동안 원심분리한다. 50마이크로리터의 리포터 기질을 발광계 플레이트에 첨가한 다음 20마이크로리터의 세포 용해물을 플레이트에 첨가하고 잠시 흔들어 혼합합니다. 마지막으로 플레이트를 발광계에 놓고 판독을 시작합니다.