Name: 루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 척수 손상과 루게릭병에서 신경전구세포를 경추 척수 복부 호른에 이식하는 방법을. 면역억제와 조직학 분석을 통해 세포 생존 및 분화를 추적합니다.

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나는 감사의 말씀을 전합니다 : Lepore의 모든 구성원, Maragakis 및 도움이 토론 Rothstein 연구소, 미국과 자금에 대한 크랙 H. Neilsen 재단의 굳는 베테랑.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).</li>
<li>Miller, R. G., Rosenberg, J. A., Gelinas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameter%3A+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28an+evidence-based+review%29%3A+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology%3A+ALS+Practice+Parameters+Task+Force%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li>
<li>Mitsumoto, H., Chad, D. A., Pioro, E. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsumoto%2C+H+%22Amyotrophic+lateral+sclerosis%22">Amyotrophic lateral sclerosis</a>. Davis, F. A. , Philadelphia. (1998).</li>
<li>Tandan, R., Bradley, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+leteral+sclerosis%3A+Part+2.+Etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis.</a> Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanisms+involved+in+motor+neuron+degeneration+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS.</a> Annu Rev Neurosci. 27, 723-723 (2004).</li>
<li>Rosen, D. R., Siddique, T., Patterson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cu%2FZn+superoxide+dismutase+gene+are+associated+with+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nature. 362, 59-59 (1993).</li>
<li>Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-327 (1997).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Howland, D. S., Liu, J., She, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+loss+of+the+glutamate+transporter+EAAT2+in+a+transgenic+rat+model+of+SOD1+mutant-mediated+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).</li>
<li>Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+expressing+human+cytosolic+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenes+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+associated+mutations+develop+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease.</a> J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).</li>
<li>McDonald, W., Becker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+promising+interventions+and+realistic+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys.+Med.+Rehabi%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals.</a> Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).</li>
<li>Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+interferon-beta+modulates+the+acute+inflammatory+response+and+recovery+when+combined+with+forced+exercise+following+cervical+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury.</a> Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1433 (2000).</li>
<li>Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuitry+and+respiratory+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+physiology+%26+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury.</a> Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).</li>
<li>Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature. 11, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+Restricted+Precursors+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System.</a> Anat Rec. 257, 137-137 (1999).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
<li>Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differences+in+onset+of+disease+and+response+to+exercise+in+a+transgenic+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS.</a> Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).</li>
<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

SOD1 G93A 마우스 및 쥐, 연령 및 그룹 내에서 동물을 섹스와 일치하고, 다른 그룹에 동일한 쓰레기 내에 동물을 배포합니다. 관련된 연구 그것은 질병 프로세스가 남성과 여성 사이에 다를 수 있기 때문에 ALS와 SCI 모델 모두에 대해 동일한 성별의 모든 동물을 사용하는 것이 바람직하지만, 그것은 또한 가능한 섹스 특정 효과를 감지하는 두 남녀의 충분한 동물을 가지고하는 것이 유용할 수 있습니다대로 이러한 현상은 SOD1 G93A의 쥐 13 SOD1 G93A 마우스 14,15로보고되었습니다. 동물에 세포 이식을위한 세 / 질병의 포인트 (ALS 동물) 또는 시간 후 부상을 (SCI 모델)을 고려하십시오. 이 전략은 가능성이 해결되는 특정 세포 메커니즘에 따라 달라질 것이다. 프로토콜은 여기에 설명된 쥐, 마우스 경추 척추 코드 11,뿐만 아니라 흉부 및 요추 수준 <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14,170 </td></tr><tr><td> 0.05 %의 트립신 </td><td> Gibco </td><td> 25,300 </td></tr><tr><td> 대두 트립신 억제제 (선택 사항) </td><td> 시그마 </td><td> T - 6522 </td></tr><tr><td> Acepromazine의 maleate (0.7 밀리그램 / kg) </td><td> Fermenta 동물 건강 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 (95 MG / kg) </td><td> 포트 닷지 동물 건강 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (10 MG / kg) </td><td> 바이엘 </td><td></td></tr><tr><td> # 11 깃털 외과 블레이드 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72044-11 </td></tr><tr><td> 면과 밀고 applicators (6 인치) </td><td> 어부 </td><td> 23-400-101 </td></tr><tr><td> 쥐 - 톱니 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 쥐 : 11023-15; 마우스 : 11042-08 </td></tr><tr><td> 중간 크기의 스프링 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15012-12 </td></tr><tr><td> 미니 스프링 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15000-10 </td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 쥐 : 16121-14; 마우스 : 16221-14 </td></tr><tr><td> Microknife </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10056-12 </td></tr><tr><td> 니들 홀더 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 12502-14 </td></tr><tr><td> 봉합 : 4-0 </td><td> Vicryl </td><td> S - 183 </td></tr><tr><td> 스테이플 : 9mm </td><td> Autoclip </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> 스테플러 : 9mm (목표 # 203-1000) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 5,000,344 </td></tr><tr><td> 온수 펌프 (T / 펌프) </td><td> Gaymar </td><td> P / N 07999-000 </td></tr><tr><td> 시클 로스 포린 A : 250.0 mg/5.0 ML의 ampules </td><td> 노바티스 / Sandimmune </td><td> NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FK - 506 </td><td> LC 연구소 </td><td> F - 4900 </td></tr><tr><td> Rapamycin </td><td> LC 연구소 </td><td> R - 5000 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> UMP2 </td></tr><tr><td> 마이크로 네 Microsyringe 펌프 컨트롤러 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> UMC4 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 연 - R </td></tr><tr><td> 10.0 μL 해밀턴 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,030 </td></tr><tr><td> 해밀턴 바늘 : 33 게이지, 45 ° 베벨, 1 인치 </td><td> 해밀턴 </td><td> 7803-05 </td></tr><tr><td> 유리 20.0 μL microcapillary pipettes (선택 사항) </td><td> 킴블 </td><td> 71900-20 </td></tr></tbody></table>

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 intraspinal 세포 이식

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

phrenic 모터 신경 세포의 손실로 인해 호흡기 손상은 인간의 외상성 척수 손상의 큰 비율 (SCI) 가지 경우 1 쇠약 결과이며, 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS) 2 환자에서 사망의 궁극적인 원인입니다. ALS는 상부의 비교적 빠른 변성 낮은 모터 뉴런이 특징입니다 치명적인 신경 질환이다. 평균 2-5년에있는 질병에 궁극적으로 쓰러지는 환자 때문에 횡경막 3 phrenic 모터 신경 세포의 innnervation의 손실로 인해 호흡 마비의 진단에 따라. 10 % 가족성 양식의하는 동안 대부분의 경우는 산발하고 있습니다. 가족성 가지 경우 대략 20 %가 염색체 21 4 잘라내기 / Zn 초과 산화물 dismutase 1 (SOD1) 유전자의 다양한 돌연변이 포인트로 연결되어 있습니다. 돌연변이 인간 SOD1 유전자를 (G93A, G37R, G86R, G85R) 운반 유전자 변형 마우스 4,5와 쥐 6 생성하고, 모터 신경 세포의 손실을 다른 동물 모델의 존재에도 불구하고, 현재이 질병의 가장 높은 사용 모델 아르되었습니다 . 척수 손상 (SCI)는 부상 7 종류, 위치 및 심각도에 따라 다양한 기능과 실제 결과 외상에서 척수에 발생하는 조건의 이질적인 집합입니다. 그럼에도 불구하고, 인간의 SCI 케이스의 약 절반으로 인해 phrenic 모터 신경 세포 손실 및 bulbospinal의 호흡 axons 1 내림차순으로 부상을 쇠약하게 호흡 부전의 결과, 자궁 지역에 영향을 미칩니다. SCI의 동물 모델의 숫자는 가장 일반적으로 사용하고 임상 - 관련 타박상 8되는, 개발되었습니다. 신경 전구체 세포 (NPCs)의 다양한 클래스의 이식 때문에 분실 또는 역기능 CNS 세포 종류가 제공하는 neuroprotection를 교체하고, 유전자 요인을 제공할 수있는 능력의 ALS 및 SCI를 포함한 외상 CNS의 부상과 neurodegeneration의 치료를위한 유망한 치료 전략 관심 9. ALS와 SCI 모두의 동물 모델 phrenic 모터 신경 세포 손실 및 결과의 호흡기 손상 10,11 포함하여이 질병의 많은 임상 - 관련 측면을 모델 수 있습니다. ALS와 SCI 이러한 동물 모델에서 호흡 기능에 NPC 기반 전략의 효능을 평가하기 위해서는 세포 개입은 특히 phrenic 모터 뉴런과 같은 therapeutically 관련 목표를 포함하는 지역으로 이동해야합니다. 우리는 이러한 SOD1 G93A 마우스 및 쥐뿐만 아니라 척수 부상 쥐 및 쥐 11으로 neurodegenerative 모델의 자궁 경부 척수 복부 회색 물질로 NPCs의 멀티 segmental, intraspinal 이식에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

횡격막 운동 신경원 소실로 인한 호흡 부전은 인간의 외상성 척수 손상(SCI) 상당수에서 나타나는 심각한 결과입니다...

본 절차의 전반적인 목표는 쥐와 생쥐 모두의 경추 척수, 즉 복측 회색질에 신경 전구 세포를 다분절 내척수 이식하는 것입니다. 이는 먼저 이식에 필요한 특정 신경 전구 세포 유형을 준비한 다음, 세포 이식을 계획한 척수의 각 지점에서 척추궁 절제술을 시행함으로써 달성됩니다.다음으로, 경추 척수의 전각에 세포를 정확하게 전달하기 위해 적절한 위치와 깊이에 세포를 정밀하게 주입합니다. 마지막 단계는 이식된 세포가 척수 내에서 생존할 수 있도록 희생 시점까지 동물에게 면역 억제제를 계속 투여하는 것입니다. 최종적으로, 면역조직화학법과 같은 조직학적 방법 및 후속 현미경 분석을 통해 이식 후 다양한 시점에서 성체 경추 척수 내 이식된 신경 전구 세포의 생존, 이동 및 분화를 추적하여 결과를 얻을 수 있습니다.본 방법에서의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 척수 수술 및 세포 이식의 많은 복잡한 단계들은 세심한 주의와 특정 기술을 요하므로 습득하기 어려우나, 시각적 시연을 통해 더 쉽게 배울 수 있기 때문입니다. 권장되는 절차를 따를 경우, 이식 3일 전부터 동물에게 cyclosporine A 10 mg/kg을 매일 피하 주사하여 면역을 억제하십시오. 설치류 유래 세포를 이식하는 경우에는 FK 506과 rapamycin을 각각 1 mg/kg씩 복강 내 주사하십시오.인간 유래 세포를 이식하려는 경우, 튼튼한 종이 클립을 구부려 리트랙터(retractors)를 제작합니다. 종이 클립의 일부를 끊어 갈고리를 만들고, 반대쪽 끝은 작은 고리 모양으로 구부립니다. 그런 다음 각 리트랙터의 고리에 실을 묶은 후, 수술 당일에 리트랙터와 수술에 사용될 모든 기구를 오토클레이브(autoclave)로 멸균합니다.서면 프로토콜에 기술된 절차에 따라 글리아 전구 세포 또는 이식할 다른 세포의 분주액을 준비합니다. 세포를 수확한 후, 세포 현탁액을 여러 개의 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 나누어 담고 젖은 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 동물에게 적절한 마취 방법을 적용하고, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 수술에 적합한 마취 수준에 도달했는지 확인합니다.전기 면도기를 사용하여 동물의 등을 면도합니다. 귀에서 약간 앞쪽(rostral)부터 등 중간 부분까지 깨끗이 면도하고, 절개 부위에 털이 들어가는 것을 방지하기 위해 피부에서 잘린 털을 제거합니다. 다음으로, 거즈 한 조각을 포비돈 아이오딘 소독액에 적셔 면도한 부위의 피부에 도포합니다. 소독액으로 최소 2회, 알코올 또는 희석된 소독제로 2회 원을 그리며 닦아냅니다.절개 부위에서 시작하여 헤어라인 방향의 바깥쪽으로 진행합니다. 멸균된 롤 거즈 패드를 깨끗한 수술 보드 위에 놓고, 패드가 움직이지 않도록 보드에 테이프로 고정합니다. 동물을 엎드린 자세(prone position)로 롤 거즈 위에 올려 놓습니다.동물의 양팔을 패드 위에 펼친 다음, 팔을 패드와 수술 보드에 테이프로 고정하여 경추 척수를 지지합니다. 경추 척수는 피부 표면 깊숙한 곳에 위치하므로, 이렇게 하면 수술 전 과정에서 작업이 더 수월해집니다. 이 과정에서는 멸균 수술 포를 사용해야 하지만, 시연을 위해 비디오에서는 이를 보여주지 않았습니다.먼저, 최저 배율로 설정된 수술 현미경을 통해 관찰하며, 날카롭고 멸균된 메스를 사용하여 두개골 기저부부터 견갑골까지 정중선 절개를 실시합니다. 그런 다음 척주 위의 세 개 근육층을 절개합니다. 최소 횟수의 절개로 모든 근육층을 자를 수 있도록 충분한 압력을 가하되, 두 개의 면봉으로 심부 조직에 손상을 줄 수 있으므로 너무 강하게 누르지 마십시오.비틀어 올리는 동작을 사용하여 상부 근육을 척추 주변 근육으로부터 분리합니다. 출혈이 발생할 수 있으므로 근육을 자르거나 찢지 마십시오. 직접 제작한 리트랙터 4개를 적절한 위치에 배치하여 근육을 견인합니다.그런 다음 4개의 견인기를 네 모서리 방향으로 당긴 후, 실을 보드에 테이프로 고정하여 견인기를 고정합니다. 최종 노출 부위는 정사각형 또는 직사각형 모양이 되어야 합니다. 쥐 치아 포셉(rat toothed forceps)과 중간 크기의 스프링 가위를 사용하여 척추의 배측 표면에서 척추 주변 근육을 제거합니다.뼈 표면을 더 잘 노출시키기 위해 뼈에 매우 가깝게 절개합니다. 절개선이 척추 표면과 평행하도록 하되, 척수로 절개되지 않도록 주의하십시오. 중간 크기의 스프링 가위를 로우 셰어(raw share)로 교체합니다.그런 다음 쥐 치과용 포셉(rat tooth forceps)으로 C2 돌기 위의 근육을 잡아 척주 전체를 고정하고, 리트랙터(raw she)를 사용하여 C4, C5 및 C6 레벨의 근육을 젖힙니다. 이후 C5에서 척추궁 절제술(laminectomy)을 시작합니다. 이때 다시 한번 쥐 치과용 포셉으로 C2를 잡아 해당 부위를 고정합니다.론쉐(raw she)로 라미나(lamina) 전체를 잡고, 도구가 척주 축과 완전히 수직이 되도록 론쉐의 위치를 잡습니다. 척수로 밀려 들어가지 않도록 주의하며 라미나를 천천히 부드럽게 부숩니다. 그런 다음 부러진 뼈 조각을 위쪽으로 조심스럽게 끌어 올립니다.다음으로, raw ger를 척주에 수직이 되도록 배치합니다. 그런 다음, 척수 표면을 기준으로 30~60도 각도로 raw ger를 뼈 아래로 조심스럽게 삽입합니다. 작은 절개를 통해 엽절제술 범위를 C4에서 C6의 모든 척추궁판까지 확장합니다.출혈이 발생할 수 있으므로 척추궁 절제술을 가쪽으로 너무 넓게 확장하지 마십시오. 현미경 배율을 약 15 x로 높여 척수로 초점을 맞춥니다. 직선형의 날카로운 기구를 사용하십시오.5번 포셉을 사용하여 경막 상단의 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 미세 스프링 가위나 마이크로 나이프를 사용하여 척주 축과 평행하게 경막을 절개합니다. 등쪽 뿌리 섬유(dorsal rootlets) 진입 구역의 바로 내측 지점에서 주사를 위한 경막 천자 부위를 확보하십시오.천자 후, 경막에서 뇌척수액이 흘러나오면 거즈나 면봉을 사용하여 척수 표면과 노출된 부위 전체의 물기를 닦아냅니다. 포셉을 사용하여 척수를 집거나 손상시키지 않도록 주의하며 경막을 잡고 척수로부터 약간 들어 올립니다. 10 µL Hamilton gast type 탈착식 바늘 주사기를 사용하여 척수의 rostral 축 방향으로 절개 부위를 약간 확장합니다.끝이 날카로운 33 gauge 45도 베벨 금속 Hamilton 바늘을 장착합니다. 한 곳의 주입 지점에 필요한 세포 현탁액 부피를 천천히 로딩합니다. 현미경으로 진행 과정을 모니터링하면서 바늘 끝을 척수 배측 표면을 향해 내립니다.원하는 해부학적 부위를 정확하게 겨냥하기 위해 주사기를 척추의 축과 일직선으로 맞추고, 바늘을 가능한 한 90도에 가깝게, 그리고 등쪽 뿌리섬유(dorsal rootlets)의 진입 구역 바로 내측을 향하게 합니다. 바늘 끝으로 척수의 표면을 살짝 터치하여 척수를 가볍게 누릅니다. 그 다음, 척수가 정상 위치로 돌아올 때까지 바늘을 후퇴시킵니다.마이크로 매니퓰레이터의 자를 사용하여 이 위치를 Z = 0.0으로 기록하십시오. 다음으로, 현미경을 통해 진행 과정을 시각적으로 모니터링하면서 바늘을 척수 쪽으로 약간 내립니다. 성체 쥐의 전각(ventral horn)을 대상으로 하기 위해 바늘을 1.5 mm만큼 더 내립니다.주입을 시작하기 전, 바늘을 2~5분 동안 그대로 둡니다. 이 시간 동안 수술 설정이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 펌프 컨트롤러를 사용하여 2~5분에 걸쳐 2 µL의 세포를 일정한 속도로 주입한 후, 바늘을 2~5분 동안 그대로 둡니다.그 다음 척수에서 바늘을 조심스럽게 뽑아냅니다. 다른 표적 부위들에 대해서도 주입 과정을 반복합니다. 모든 표적 부위에 주입이 완료되면, 현미경 배율을 가장 낮게 설정하고 봉합합니다.吻측-尾측 축을 따라 세 곳에 4-0 봉합사를 사용하여 상부의 근육층 세 층을 한꺼번에 봉합합니다. 9mm 상처 클립으로 피부를 스테이플링하여 봉합하며, 스테이플 간격이 약 0.5cm가 되도록 합니다. 상처가 완전히 치유되기 전에 동물이 스테이플을 잡아뜯는 것을 방지하기 위해 지침기로 스테이플을 단단히 고정합니다.적신 거즈를 사용하여 절개 상처 부위에 포비돈 IRD 소독액을 도포하고, 순환식 온수 패드 위에서 동물이 마취에서 회복되도록 합니다. 희생 시까지 cyclosporine A 또는 FK 5 0 6 rapamycin 주사를 매일 계속 투여하였으며, 50, 000 마리의 생쥐가 도착했습니다. SOD one G 93 a 랫드의 척수 C four 레벨 복측각에 glio 전구세포를 이식하였습니다.이 이미지는 두 마리의 양성 마우스가 도달했으며, 이식된 세포가 이식 후 1개월 시점에 생존해 있고, 세포들이 복측 회색질에 국소화되었으나 점선으로 표시된 바와 같이 내측 주입 지점이 외측 복측각을 벗어났음을 보여줍니다. 여기서 볼 수 있듯이, 이 영역에 훨씬 더 많은 수의 세포를 주입하면 주입 지점과 바늘 경로를 따라 손상이 발생합니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 6곳의 주입 지점에 대해 약 45분에서 60분 정도 소요됩니다.

intraspinal-cell-transplantation-for-targeting-cervical-ventral-horn

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

출처: Zweckberger, K., et al. 실험적 경추 척수 손상에서 신경 전구 세포와 자가 조립 펩타이드의 시너지 사용.  J. Vis. 경험. (2015).이 프로토콜은 쥐 모델에서 척수 손상 복구를 위한 표적 주사 접근법을 보여줍니다. 여기에는 자가 조립 펩타이드(SAP)를 병변 코어에 전달하여 지지 스캐폴드를 만든 다음 병변 주위에 신경 전구 세포(NPC)를 주입하여 조직을 리모델링하는 작업이 포함됩니다.

쥐 모델에서 척수 복구를 위한 자가 조립 펩타이드 및 신경 전구체 세포 주입

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

자가조립 펩타이드(SAP)와 신경전구세포(NPC)를 성장 인자와 함께 사용하여 경추 척수 손상을 치료하는 것은 재생과 회복을 촉진하는 유망한 접근 방식입니다. 경추 SCI의 타박상/압박 동맥류 클립 랫 모델과 수액 주입 및 NPC 이식을 포함하는 복합 치료가 확립되었습니다.

실험 경추 척수 손상의 신경 전구체 세포 및 자기 조립 펩티드의 시너지 사용

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

심각한 척수 손상은 종종 조직 결함을 초래합니다. 급성 손상 후 및 완전한 척수 절개 후 5주 후에 기계적 마이크로 커넥터 시스템의 이식을 통해 쥐의 조직 적응, 재생 반응 및 기능 개선을 촉진하기 위해 이러한 격차를 성공적으로 메우기 위한 두 가지 가능성이 설명됩니다.

실험 전략은 급성 및 만성 병변 후 부상 척수에서 큰 조직의 차이를 극복하기

이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.

PVDF TrFE 도관 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 하 Transected 쥐 척수 젊고 아름 다운 여자를 다리 안에 이식 Schwann 세포

이 논문에서는 세포 대체 요법을 테스트하기 위한 생체 외 모델로 신경 줄기 세포로 이식된 장기 척수 기관형 절편을 생성하고 유지하기 위한 재현 가능한 방법을 제공합니다.

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for validating Cell transplantation in Spinal Cord (척수 손상에서 세포 이식을 검증하기 위한 플랫폼으로서의 장기 마우스 척수 유기형 절편 배양)

이 연구에서는 척수 손상 복구를 위해 지방 유래 줄기 세포의 재생 촉진 거동을 조사하고 활용하는 데 사용할 수 있는 신경 모방 복합 하이드로겔을 개발하고 특성화했습니다.

Stem Cell Delivery를 이용한 척수 손상 조합치료제 개발

본 프로토콜은 종양 세포를 추간 공간에 주입하여 척수 신경교종의 재현 가능한 쥐 모델을 개발하는 방법을 설명하며, 연구 및 치료 개발을 위한 보다 효과적이고 덜 침습적인 접근 방식을 제공합니다.

종양 세포를 마우스의 척수에 외과적 이식

학습하세요 척수 손상과 루게릭병에서 신경전구세포를 경추 척수 복부 호른에 이식하는 방법을. 면역억제와 조직학 분석을 통해 세포 생존 및 분화를 추적합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

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