0 조회수 • 4:33 분 • July 8th, 2025
마우스 대식세포가 포함된 채널 슬라이드를 가져 가십시오. 이 채널은 배지로 채워진 저장소에 연결되어 대식세포에 영양분을 공급합니다.
배지를 특정 표면 당단백질에 결합하여 대식세포를 표지하는 배지 함유 형광 태그 항체로 교체합니다.
형광 표지된 세포막이 있는 인간 적혈구(RBC)를 취합니다. 글리코포린 A에 특이적으로 결합하는 마우스 IgG 항체로 적혈구를 옵소나이즈합니다.
IgG-옵소화된 적혈구를 대식세포 함유 슬라이드에 추가합니다. 대식세포 Fc 수용체는 적혈구에 있는 IgG의 Fc 영역에 결합하여 접촉 영역 주위에 Fc 수용체를 클러스터링하고 식균 작용을 위해 적혈구를 표시합니다.
결합은 세포 내 신호 전달 경로를 유발하고 GTPase를 활성화합니다. 활성화된 GTPase는 액틴 재구성 및 중합을 촉진하여 사상포충이라고 하는 얇은 막 돌출부를 형성합니다.
또한, 사상체는 적혈구 주위로 확장되어 발달 중인 식세포 컵 내에서 RBC를 둘러싸고 있습니다. 컵의 가장자리가 융합되어 분해를 위해 옵소화된 적혈구를 내재화하는 식세포를 형성합니다.
공초점 현미경을 사용하여 단일 식세포 사건의 타임랩스 이미지를 얻습니다.
복막 대식세포를 표지하기 위해, 각 채널 슬라이드의 중탄산염 배지를 HEPES가 보충된 완전한 배지로 교체하고, 슬라이드를 기울여 100마이크로리터의 형광 태그가 있는 관심 마우스 대식세포 특이적 항체가 슬라이드의 100마이크로리터 채널의 개구부에 적하 단위로 추가되도록 한다. 다운스트림 저장소로 흐르는 배지를 흡인하고 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 습한 챔버에서 세포를 20분 동안 배양합니다.
복막 세포가 표지되는 동안 4-2,000개의 적혈구 샘플을 부드럽게 혼합하고 400마이크로리터의 세포를 층류 후드 내부의 가열된 알루미늄 블록에 있는 새로운 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 약 5-8분 동안 옮깁니다.
세포가 섭씨 37도까지 예열되면 0.4마이크로리터의 적절한 적색 형광 원형질막 염색제를 세포와 혼합하고 세포를 열 블록에 다시 넣습니다. 5분 후, 신선한 HEPES가 보충된 완전 배지 1.6밀리리터를 첨가하고 원심분리하여 세포를 세척합니다. 튜브를 돌려 적혈구 알갱이를 식별합니다.
1-1.5밀리리터 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 두 부피로 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 2,000마이크로리터의 신선한 HEPES 보충 완전 배지를 세포와 혼합합니다. 펠릿을 원심분리하고 400마이크로리터의 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 플라즈마 멤브레인 염색에 대해 튜브 PMS에 라벨을 붙입니다. 20분 복막 세포 라벨링 배양이 끝나면 1밀리리터의 신선한 완전 HEPES 보충 배지로 슬라이드를 세척합니다.
적혈구를 옵소나이즈화하려면 마우스 IgG2b 단클론 항인간 CD235a 항체 1마이크로리터를 PMS 샘플 튜브에 추가합니다. 1분에 한 번 혼합하면서 섭씨 37도에서 8분 후, 원형질막 염색, IgG-옵소나이즈, 인간 적혈구 100마이크로리터를 복막 대식세포 함유 채널 슬라이드로 옮깁니다. 인간 적혈구가 추가되자마자 스테이지 인큐베이터를 섭씨 37도로 설정한 상태에서 회전 디스크 공초점 현미경에 슬라이드를 장착하고 즉시 세포 이미징을 시작합니다.