0 조회수 • 2:53 분 • July 8th, 2025
시작하려면 분석 중 혈청 에스테라제 간섭을 최소화하기 위해 무혈청 배지에 암세포가 들어 있는 튜브를 사용합니다. 비형광 칼세인 AM 염료와 함께 배양합니다.
활성 세포내 에스테라아제는 칼세인 AM을 세포질에 남아 있는 막 불투과성 형광 칼세인 염료로 가수
분해합니다.테스트 웰에 칼세인 염색 암세포와 이펙터 NK 세포를 플레이트하는 반면, 대조군 웰에는 NK 세포가 없는 칼세인 염색 암세포만 포함됩니다.
NK 세포의 활성화 세포 표면 수용체는 암세포의 활성화 리간드에 결합하여 면역 시냅스를 형성합니다. 이 결합은 NK 세포 신호 전달을 활성화하여 퍼포린과 그란자임을 포함하는 세포독성 과립을 방출을 위해 시냅스 쪽으로 분극화합니다.
퍼포린은 암세포막 기공을 형성하여 그란자임의 세포 진입을 촉진하고 세포사멸을 시작합니다. 손상된 막 무결성은 형광 칼세인 누출을 유발하여 암세포 형광을 감소시킵니다.
웰의 형광 이미지를 캡처합니다.
대조군 웰보다 NK 세포 함유 웰에서 형광 살아있는 암세포의 수가 감소한 것은 암세포에 대한 NK 세포 매개 세포독성을 나타냅니다.
칼슘 AM을 사용하여 NK 세포 매개 세포독성을 평가하기 위해, 인간 간암 세포주 세포를 70% 내지 80% 컨플루엔시티로 성장시킨 후, 3밀리리터의 무혈청 DMEM에 세포를 재현탁하고 실온에서 30분 동안 1.5마이크로리터의 10밀리몰 칼슘 AM 용액으로 세포를 표지합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 세척당 5밀리리터의 PBS로 세포를 2회 세척합니다.
배양 배지 농도의 밀리리터당 1 x 105 세포로 세포를 재현탁하고, 100마이크로리터의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 처리 조건당 3중으로 추가합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 배양 배지에 1 x 105개의 인간 NK 세포를 표적 세포의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 4시간 동안 넣습니다.
배양이 끝난 후, 형광 현미경에서 10배 배율로 각 처리 조건의 각 반복에 대해 칼슘 AM 양성 세포의 최소 10개의 서로 다른 이미지 필드를 캡처합니다. 그런 다음 공식을 사용하여 세포독성 비율을 계산합니다.