화학요법 자극에 대한 반응으로 자연살해세포(Natural Killer Cell Migration in Response to Chemotactic Stimuli) 측정

멀티웰 플레이트에 케모카인과 같은 화학유인제를 추가하는 것으로 시작합니다.

적절한 기공 크기의 트랜스웰 투과성 챔버를 웰에 넣습니다. 자연 살해 또는 NK 세포 현탁액을 상부 챔버에 추가하고 배양합니다.

소수의 케모카인 분자는 막을 통해 확산되어 NK 세포 수용체에 결합합니다. 이것은 세포골격 변화를 촉진하는 신호 전달 경로를 유발하여 하부 챔버에서 더 높은 화학 유인 농도를 향한 방향성 세포 이동을 초래합니다.

배양 후, 고정된 부피의 이동된 세포를 하부 챔버에서 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 튜브로 옮깁니다. 미리 정해진 수의 형광 계수 비드를 추가하고 FACS 기반 세포 계수를 수행합니다.

다음 공식을 사용하여 샘플에서 이동된 NK 세포의 절대 수를 결정합니다.

도트 플롯은 형광 및 산란 특성을 기반으로 별개의 영역으로 분리된 계수 비드와 세포의 수를 제공합니다.

화학주성 자극에 대한 반응으로 NK 세포 이동을 측정하기 위해, 70% 내지 80% 합류 배양에서 인간 NK 세포를 수집하고, 무혈청 NK 세포 배양 배지 농도의 밀리리터당 2.5 x 10⁶ 세포로 세포를 재현탁한다. 다음으로, 웰당 관심 있는 NK 세포 화학유인제를 함유하는 무혈청 배지 600마이크로리터를 추가합니다.

그리고 5마이크로미터 기공이 있는 직경 6.5mm의 배양 인서트 1개를 배지의 각 웰에 넣습니다. 그런 다음 각 인서트의 상부 구획에 100마이크로리터의 NK 세포를 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 4시간 동안 넣습니다.

배양이 끝나면 각 웰의 바닥에서 부착되지 않은 이동 세포의 전체 부피를 개별 5밀리리터 FACS 튜브로 옮기고 미리 결정된 수의 유세포 분석 계수 비드를 15마이크로리터 각 튜브에 추가합니다. 그런 다음 유세포 분석기를 사용하여 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 각 세포 샘플을 평가하고 공식을 사용하여 이동된 NK 세포의 절대 수를 계산합니다.