복막 대식세포(Peritoneal Macrophage)에 의한 Apoptotic Thymocytes의 Efferocytosis 분석

에페로사이트토시스는 식세포 세포가 세포사멸 세포를 제거하는 과정입니다.

efferocytosis를 분석하기 위해, 세포사멸에 민감한 마우스 흉선 세포를 얻으십시오. 세포 투과성 CFSE 염료와 함께 배양합니다.

세포내 에스테라아제는 CFSE를 세포 불투과성 형광 염료로 절단하여 흉선세포를 염색합니다. 과도한 염색을 방지하기 위해 열 비활성화 세럼을 첨가하십시오.

염색된 흉선세포를 배양 플레이트에 도금합니다. 중요한 세포 신호 전달 캐스케이드를 방해하여 세포사멸을 유도하는 단백질 키나아제 억제제인 스타우로스포린을 추가합니다. 또한, 포스파티딜세린 잔기는 세포막의 외부 전단지로 이동하여 "먹기 신호"로 기능합니다.

특정 수용체 티로신 키나아제를 발현하는 활성화된 마우스 복막 대식세포를 포함하는 멀티웰 플레이트 웰에 증가하는 세포사멸성 흉선세포 농도를 추가합니다.

이 키나아제는 세포사멸 흉선세포에 노출된 포스파티딜세린에 결합하여 대식세포에 의한 내재화를 촉진합니다.

배양 후, 자유 부유 세포사멸성 흉선 세포를 제거합니다. 대식세포 CD11b 분자에 결합하는 형광단 태그가 있는 항-CD11b 항체를 추가합니다.

형광 현미경을 사용하여 서로 다른 형광 대식세포 내에서 형광 세포사멸성 흉선세포를 관찰하여 활출혈구증가증을 나타냅니다.

세포사멸성 흉선세포 농도가 높은 우물은 증가된 내재화된 흉선세포를 나타냅니다.

순진한 C57/Black-6 마우스의 흉강을 연 후 흉선세포를 수확하려면 구부러진 가는 끝 겸자를 사용하여 흉선을 뽑습니다. 장기를 10밀리리터의 RPMI-1640 배지가 들어 있는 조직 배양 접시에 넣습니다. 2개의 현미경 슬라이드의 반투명 끝에 대해 전체 흉선을 갈아서 생성된 조직 현탁액을 70마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 걸러냅니다. 원심분리로 흉선세포를 수집하고 펠릿을 40밀리리터에 재현탁합니다.

계수 후, 세포를 다시 원심분리하고 50밀리리터 튜브당 20밀리리터의 신선한 PBS에 최대 2 x 10⁸ 세포를 재현탁합니다. 튜브당 20밀리리터의 PBS에 5마이크로몰 CFSE로 세포를 표지합니다. 튜브를 2-3회 뒤집어 혼합한 후 빛으로부터 보호된 실온에서 2분 이상 동안 흉선 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 10밀리리터의 열 비활성화 말 혈청으로 반응을 멈추고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.

표지된 세포를 계수 및 원심분리를 위해 40밀리리터의 신선한 PBS에 재현탁한 다음 40밀