타겟 검증을 위해 세포 내 amastigote의 정량이 중요한 이유는 무엇인가요?

세포 내 무편모형(amastigotes)의 수를 정량화하면 대식세포 내에서 Leishmania의 독성과 복제 능력을 직접 측정할 수 있으며, 이를 통해 특정 화합물이 병원체의 세포 내 생애 주기를 방해하는지 평가할 수 있습니다. 이러한 표현형 판독법은 분자적 억제와 질병 관련 시스템에서의 기능적 결과물을 연결함으로써 표적 검증을 뒷받침합니다.

세포 내 복제 변수의 분리가 어떻게 발견 파이프라인을 지원합니까?

본 분석법은 기생포낭(parasitophorous vacuoles) 내의 무편모형(amastigote) 형성에 집중함으로써, 세포 내 복제 단계를 주요한 병원성 의존 변수로 분리하여 연구자가 숙주 세포 내에서의 분화 또는 생존을 특이적으로 차단하는 화합물을 평가할 수 있도록 합니다. 이를 통해 철 대사, 파고솜(phagosome) 성숙 또는 기생충 지속 기전과 관련된 표적의 리스크를 줄일 수 있습니다.

감염된 대식세포 핵의 정량적 측정으로 무엇을 확인할 수 있습니까?

대식세포 핵 주변에 군집을 이룬 DAPI 염색 amastigote 핵을 정량적으로 측정하면 실험 조건별 감염률을 객관적으로 비교할 수 있으며, 이는 스크리닝 캠페인에서 용량-반응 분석 및 히트 확인을 지원합니다. 이러한 데이터는 세포 내 기생충 부하에 미치는 화합물의 효과를 평가하기 위한 확장 가능한 현미경 기반 판독값을 제공합니다.

교차 기능 협업에서 재현성 요구사항이 중요한 이유는 무엇입니까?

표준화된 대식세포 분화, 감염 시점 및 고정 프로토콜을 포함하여 정의된 재현 요구 사항은 실험실 및 프로젝트 팀 간의 분석 일관성을 보장하여 신뢰할 수 있는 데이터 공유와 비교를 가능하게 합니다. 이는 발견, 스크리닝 및 전임상 그룹이 비교 가능한 독성 평가 데이터를 생성할 수 있도록 함으로써 중개 연구의 연속성을 지원합니다.

구현 전 어떤 통계 분석 역량이 필요한가요?

구현을 위해서는 t-검정 또는 ANOVA와 같은 통계적 방법을 사용하여 조건별 감염 세포 빈도를 정량화하고 비교함으로써, 처리군과 대조군 간의 amastigote 부하의 유의미한 차이를 결정하는 능력이 필요합니다. 이를 통해 데이터 기반의 히트(hit) 선택과 리드 최적화 과정에서의 구조-활성 관계 분석이 가능해집니다.

배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

JoVE Encyclopedia of Experiments

면역학

0 조회수 • 4:46 분 • July 8th, 2025

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커버슬립에 골수 유래 대식세포가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

기생충의 감염 단계인 리슈만충 전단기체로 대식세포를 치료합니다.

배양하는 동안 기생충은 대식세포와 상호 작용하여 상호 작용 부위 주변에서 F-액틴의 조립을 촉진합니다.

대식세포는 F-액틴으로 둘러싸인 식체에서 기생충을 삼켜 복제 틈새인 기생 액포 또는 PV를 형성합니다.

PV 내에서 기생충은 생존 인자를 방출하여 액포 주변의 F-액틴 축적을 증가시키고 리소좀과의 융합을 억제합니다.

또한 기생충은 대식세포 펩타이드 호르몬인 헵시딘의 생산을 상향 조절하여 철분 방출을 억제하고 세포내 철분 수치를 높입니다.

액포로의 철분 유입은 전포조체가 병원성 무박기체로 분화하는 것을 촉진하고 증식을 촉진하여 독성을 향상시킵니다.

배양 후, 유리 기생충을 제거하기 위해 세척한 다음 감염된 대식세포를 고정하고 투과시킵니다.

감염된 대식세포와 무스티고트의 핵을 염색하기 위해 핵산 형광 염료를 도입합니다.

형광 현미경으로 대식세포의 큰 핵 주위에 모여 있는 작은 핵은 세포내 기생충의 존재를 확인시켜 리슈만모충의 독성을 입증합니다.

배양 후 7일 또는 8일째에 진공 라인에 장착된 흡인 팁을 사용하여 4개의 오토클레이브 멸균된 12mm 유리 커버슬립을 겹치지 않고 6웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥으로 옮깁니다. 실험의 각 시점에 대해 동일한 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 골수 유래 대식세포 배양물을 신선한 섭씨 37도 PBS와 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5밀리리터로 2회 세척하고 각 플레이트에 1밀리몰 EDTA를 보충합니다.

섭씨 37도에서 5분 후, 분리된 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 칼슘과 마그네슘이 없는 추가 5밀리리터의 PBS로 각 플레이트를 두 번 헹굽니다. 원심분리 후, 얼음 위에 5-10ml의 신선한 골수 유래 대식세포 배지에 대식세포를 재현탁합니다. 계수 후, 신선한 골수 유래 대식세포 배지에서 세포를 밀리리터당 5 x 10⁵ 농도로 희석하고 웰당 2밀리리터의 세포를 6웰 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

세포를 L amazonensis로 감염시키려면 기생충 현탁액을 적절한 실험적 감염 다중도로 희석하고, 실험의 모든 시점을 포함하여 모든 6웰 플레이트의 각 웰에 50 내지 100마이크로리터의 기생충을 첨가한다. 적절한 감염 기간과 온도를 위해 골수 유래 대식세포를 배양합니다.

그런 다음 웰당 칼슘 또는 마그네슘이 없는 신선한 섭씨 37도 PBS 2밀리리터로 웰을 세 번 세척하고 초기 시점 샘플을 1.5-2ml의 2% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정합니다. 이후 시점에 해당하는 플레이트의 경우, 각 웰에 신선한 골수 유래 대식세포 배지 2밀리리터를 추가하고 플레이트를 적절한 인큐베이터로 되돌립니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 남은 각 시점에 대해 세포를 고정 및 세척하고 샘플을 섭씨 4도에서 신선한 PBS에 보관합니다.

DAPI로 세포를 염색하려면 상청액을 칼슘과 마그네슘이 없는 신선한 PBS 1.5ml로 교체하고 실온에서 10분 동안 0.1% 비이온성 세제를 보충한 다음 칼슘 또는 마그네슘이 없는 PBS로 2밀리리터 세척을 3회 합니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 PBS 1밀리리터에 DAPI 밀리리터당 2마이크로그램으로 세포를 염색합니다. 세 번 세척한 후, 커버슬립을 셀 쪽이 아래로 향하도록 시중에서 판매되는 퇴색 방지 마운팅 시약이 장착된 개별 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다.

그런 다음 감염된 세포의 수를 정량화하기 위해 형광 현미경의 100x 침지 오일 대물렌즈와 Emanuel 카운터를 사용하여 각 큰 DAPI 염색 대식세포 핵 주위에 모여 있는 더 작은 무스티고트 핵의 수를 식별합니다.