배양된 대식세포 내 Leishmania Virulence 평가

커버슬립에 골수 유래 대식세포가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

기생충의 감염 단계인 리슈만충 전단기체로 대식세포를 치료합니다.

배양하는 동안 기생충은 대식세포와 상호 작용하여 상호 작용 부위 주변에서 F-액틴의 조립을 촉진합니다.

대식세포는 F-액틴으로 둘러싸인 식체에서 기생충을 삼켜 복제 틈새인 기생 액포 또는 PV를 형성합니다.

PV 내에서 기생충은 생존 인자를 방출하여 액포 주변의 F-액틴 축적을 증가시키고 리소좀과의 융합을 억제합니다.

또한 기생충은 대식세포 펩타이드 호르몬인 헵시딘의 생산을 상향 조절하여 철분 방출을 억제하고 세포내 철분 수치를 높입니다.

액포로의 철분 유입은 전포조체가 병원성 무박기체로 분화하는 것을 촉진하고 증식을 촉진하여 독성을 향상시킵니다.

배양 후, 유리 기생충을 제거하기 위해 세척한 다음 감염된 대식세포를 고정하고 투과시킵니다.

감염된 대식세포와 무스티고트의 핵을 염색하기 위해 핵산 형광 염료를 도입합니다.

형광 현미경으로 대식세포의 큰 핵 주위에 모여 있는 작은 핵은 세포내 기생충의 존재를 확인시켜 리슈만모충의 독성을 입증합니다.

배양 후 7일 또는 8일째에 진공 라인에 장착된 흡인 팁을 사용하여 4개의 오토클레이브 멸균된 12mm 유리 커버슬립을 겹치지 않고 6웰 배양 플레이트의 각 웰 바닥으로 옮깁니다. 실험의 각 시점에 대해 동일한 플레이트를 준비합니다. 다음으로, 골수 유래 대식세포 배양물을 신선한 섭씨 37도 PBS와 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5밀리리터로 2회 세척하고 각 플레이트에 1밀리몰 EDTA를 보충합니다.

섭씨 37도에서 5분 후, 분리된 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 칼슘과 마그네슘이 없는 추가 5밀리리터의 PBS로 각 플레이트를 두 번 헹굽니다. 원심분리 후, 얼음 위에 5-10ml의 신선한 골수 유래 대식세포 배지에 대식세포를 재현탁합니다. 계수 후, 신선한 골수 유래 대식세포 배지에서 세포를 밀리리터당 5 x 10⁵ 농도로 희석하고 웰당 2밀리리터의 세포를 6웰 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.

세포를 L amazonensis로 감염시키려면 기생충 현탁액을 적절한 실험적 감염 다중도로 희석하고, 실험의 모든 시점을 포함하여 모든 6웰 플레이트의 각 웰에 50 내지 100마이크로리터의 기생충을 첨가한다. 적절한 감염 기간과 온도를 위해 골수 유래 대식세포를 배양합니다.

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