Establishing an Infection Model Through Infection Model Through Microinjection of Gastric Organoids with Pathogenic Bacteria(위 오가노이드와 병원성 세균의 미세주입을 통한 감염 모델 구축)

입체 현미경으로 위 오가노이드, 분화된 위 세포로 구성된 3차원 세포 구조, 줄기 세포를 관찰합니다.

위 병원균인 헬리코박터 파일로리가 함유된 마이크로인젝터를 도입합니다.

바늘을 표적 오가노이드에 삽입하고 박테리아 현탁액을 주입합니다.

내강 내에서 흐린 용액이 발생하는 것을 관찰하십시오.

H.pylori는 표면에 특정 접착 단백질을 사용하여 위 세포 수용체에 결합하여 박테리아와 숙주 세포 사이에 안정적인 상호 작용을 설정합니다.

이 상호 작용은 숙주 세포막을 향해 확장되는 큰 터널 모양의 구조인 박테리아 분비 필루스의 신장을 유발합니다.

H.pylori는 분비 필루스를 사용하여 세포독성 관련 유전자 A 또는 CagA를 포함한 독성 인자를 숙주 세포에 주입합니다.

세포 내부로 들어가면 CagA는 숙주 세포 키나아제에 의해 인산화됩니다.

인산화된 CagA는 숙주 세포 기능을 변경하여 암 변형을 촉진하는 여러 세포내 신호 전달 캐스케이드를 조절하지 않습니다.

추가 분석을 위해 감염된 오가노이드를 수집합니다.

오가노이드의 미세 주입을 시작하려면 H. pylori 박테리아를 수확하고 표준 프로토콜에 따라 기초 배지에서 세척합니다. 박테리아 수를 결정하기 위해 광학 밀도를 측정한 후, 배양액을 기초 배지에서 밀리리터당 1 x 10⁹ 박테리아로 희석합니다.

마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 두 개의 주사 바늘로 당기고 깨끗한 페트리 접시에 보관합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 주사 바늘 끝을 부수어 너비가 약 10마이크로미터인 구멍을 만듭니다.

실체현미경에서 작업하고 멸균 배양 후드 내부에 설치하고 바늘을 주입 홀더에 삽입하고 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 약 10마이크로리터의 박테리아 용액을 바늘에 넣습니다. 그런 다음 위 오가노이드가 포함된 4웰 세포 배양 플레이트를 입체 현미경 아래에 놓습니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 오가노이드 가까이에 배치합니다. 바늘을 한 번의 빠른 움직임으로 오가노이드에 삽입한 다음 약 0.2마이크로리터의 박테리아 용액을 오가노이드 중앙에 주입합니다. 경험을 통해 우물에 있는 가장 큰 오가노이드 중 약 30개를 5분 안에 주입할 수 있습니다. 주입된 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양합니다.

종종 이 기술을 처음 접하는 개인은 오가노이드를 효율적으로 표적으로 삼는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 마우스 위 오가노이드는 낭포성으로 성장하며 표적이 되기 가장 쉽습니다. 따라서 예를 들어 염료와 함께 마우스 위 오가노이드를 주입하는 것이 이 기술에 대한 좋은 방법이 될 수 있습니다.