진핵 세포 내 Coxiella 돌연변이의 세포 내 성장 평가

부착된 상피 세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 가져와 녹색 형광 단백질 태그가 있는 Coxiella 돌연변이체로 처리합니다. 일부는 복제에 중요한 IV형 분비 시스템 유전자 또는 T4SS 유전자에 돌연변이가 있습니다.

복제 돌연변이는 상피 세포와 상호 작용하여 Coxiella 삼킴을 유발하고 Coxiella 함유 액포 또는 CCV를 형성하고 리소좀 관련 막 당단백질-1 또는 LAMP1을 CCV로 모집합니다.

이는 IV형 분비 시스템을 통해 이펙터 단백질이 세포질로 분비되는 것을 촉진하여 박테리아 복제를 촉진합니다.

T4SS 유전자 돌연변이가 있는 돌연변이는 복제되지 않은 상태로 남아 있습니다.

배양 후 형광 염료로 세포를 염색하고 고정한 다음 세포막을 투과시킵니다.

CCV에서 LAMP1 단백질과 상호 작용하는 LAMP1 특이적 1차 항체를 도입합니다.

적색 형광단 표지 2차 항체와 오버레이하여 1차 항체와 상호 작용하는 반면 Hoechst 염료는 세포의 핵을 염색합니다.

낙후형광 현미경에서 핵 근처에 더 적은 녹색 콕시엘라를 포함하는 적색 형광 액포는 콕시엘라 돌연변이체의 복제 결함을 나타냅니다.

그러나 세포 내부에 많은 녹색 콕시엘라를 포함하는 액포는 복제 콕시엘라 돌연변이체의 성공적인 세포내 성장을 나타냅니다.

텍스트 프로토콜에 따라 RPMI 배지에서 밀리리터당^{10 5} 세포의 Vero 세포 현탁액을 준비한 후, 평평하고 투명한 바닥이 있는 검은색 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 현탁액을 분배합니다. 플레이트를 400배g, 실온에서 5분 동안 원심분리하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 밤새 배양합니다.

다음날, 콕시엘라 돌연변이체가 포함된 실온 96웰 플레이트에서 해동하고 딥웰 96웰 플레이트에서 페놀 레드 및 FBS가 없는 300마이크로리터의 RPMI에 150마이크로리터의 박테리아 현탁액을 희석합니다. 다음으로, Vero 세포에서 배지를 제거하고 희석된 Coxiella 돌연변이체의 웰당 100마이크로리터를 분배합니다. A1 웰을 음성 대조군으로 사용하고 A2 및 A3 웰을 양성 대조군으로 사용합니다.

에어로졸 밀폐 원심분리기 플레이트 홀더를 사용하여 플레이트를 400배 g 및 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 2시간 동안 배양한 후, 박테리아 함유 배지를 신선하고 완전한 RPMI 배지의 웰당 100마이크로리터로 교체합