혐기성 박테리아-숙주 세포 상호 작용을 연구하기 위한 박테리아 감염 분석

내피 세포 배양으로 시작합니다.

미디어를 혐기성 미디어로 교체합니다. 온도 평형을 위해 혐기성 챔버에서 배양합니다.

병원성 혐기성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis를 넣고 잠시 배양합니다.

박테리아는 선공으로 알려진 단백질 돌출부를 가지고 있으며, 이는 내피 세포의 특정 접착 분자에 결합하여 박테리아 부착을 촉진합니다.

이 결합은 세포내 신호 전달 캐스케이드를 유발하여 액틴 세포골격 재배열과 박테리아가 파고솜으로 내재화하는 결과를 초래합니다.

배양 후 배지를 제거합니다. 부착되지 않은 세포외 박테리아를 제거하기 위해 혐기성 완충액으로 세척합니다.

순한 세제를 첨가하여 숙주 세포막을 투과화하고 세포 용해를 유도하여 손상을 일으키지 않고 내재화 및 표면에 부착된 박테리아를 방출합니다.

용해물 함유 박테리아를 배지로 희석하고 연속 희석액을 준비합니다.

이 희석액을 혈액 한천 플레이트에 접시합니다. 혐기성 조건에서 배양하여 Porphyromonas gingivalis가 증식하고 콜로니를 형성할 수 있도록 합니다.

배양 후 각 플레이트의 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하여 표면 부착 및 내재화된 박테리아를 정량화하여 박테리아-숙주 세포 상호 작용을 나타냅니다.

Porphyromonas gingivalis의 배양 및 실험을 위해 비닐 혐기성 챔버는 80% 질소, 10% 수소 및 10% 이산화탄소를 포함하는 인공 대기로 유지됩니다.

시

약의 평형을 이루기 위해 24시간 전에 혐기성 챔버 내부에 혈액 한천 플레이트 30개, PBS 500밀리리터, 혈관 내피 성장 인자 또는 VEGF 배지 밀리리터를 넣습니다.

VEGF 배지의 6웰 플레이트에서 웰당 5개의 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 10배 4회 시드하고 부착을 위해 세포 배양 인큐베이터에 밤새 둡니다. 첨부된 텍스트에 설명된 대로 뇌-심장 주입 또는 BHI 배지에서 Porphyromonas gingivalis 배양물을 준비하고 660나노미터에서 배양물의 광학 밀도가 0.5에서 0.7 사이인 동안 배양물이 로그 단계에 도달하도록 합니다.

박테리아를 15밀리리터 튜브로 옮기고 호기성 노출을 방지하기 위해 캡 주위에 파라필름 조각을 감습니다. 그런 다음 박테리아를 5,000배 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 혐기성 챔버 내부에서 펠릿화된 박테리아를 혐기성 PBS로 세척하고 10분 동안 5,000배 g으로 다시 회전시킵니다. VEGF 배지에 박테리아를 재현탁합니다.

HUVEC를 Porphyromonas gingivalis로 감염시키려면 인큐베이터에서 혐기성 챔버로 6웰 플레이트를 옮깁니다. 테스트 웰에서 배지를 흡인하고 혐기성 PBS로 세 번 세척합니다.

트리판 블루 배제 분석법으로 하나의 대표 웰에서 세포 수를 결정합니다. 그런 다음 혐기성 VEGF 배지의 웰당 2밀리리터를 추가하고 플레이트를 혐기성 인큐베이터에 섭씨 37도에서 20분 동안 놓아 평형을 이룹니다.

박테리아의 광학 밀도를 결정하고 박테리아 대 세포 비율의 100 대 1 감염 다중도로 세포를 감염시키기 위해 적절한 부피의 VEGF 배지에 재현탁합니다. 박테리아 현탁액을 세포에 첨가하고 감염을 위해 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 세포 용해의 경우 혐기성 챔버 내부에서 BHI 배지에서 부피당 1% 중량의 사포닌 용액을 준비하고 0.2미크론 필터를 통해 여과합니다.

숙주 세포와의 박테리아 상호 작용을 연구하려면 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 제거하고 감염 배지를 흡인합니다. 혐기성 PBS로 세 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 사포닌 용액 2밀리리터를 넣고 세포 용해를 허용하기 위해 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 웰 바닥에서 세포를 긁어내고 BHI 배지로 세포 용해물을 1:1로 희석합니다. 그런 다음 1에서 100까지 연속적으로 희석합니다. 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석액 200마이크로리터를 플레이트합니다. 플레이트를 파라필름으로 싸고 섭씨 37도의 혐기성 인큐베이터에서 7일 동안 배양하여 콜로니 형성을 허용합니다. 그런 다음 라이트 박스를 사용하여 각 플레이트의 콜로니 형성 단위 또는 CFU를 계산합니다.