숙주 내피 세포 내 내재화된 혐기성 박테리아의 시각화

혐기성 병원성 박테리아인 Porphyromonas gingivalis의 현탁액으로 시작합니다.

비형광성 세포투과성 염료인 BCECF-AM을 첨가합니다.

활성 세포질 에스테라아제는 염료를 형광성 세포 불투과성 형태로 가수분해하여 박테리아를 염색합니다.

원심 분리기. 혐기성 배지에 박테리아를 재현탁합니다.

표지된 박테리아를 부착된 인간 내피 세포가 있는 커버슬립이 포함된 멀티웰 플레이트 웰에 추가합니다.

혐기성 챔버에서 배양합니다.

박테리아 선모는 내피 세포 표면 수용체에 결합하여 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 시작합니다.

이것은 파고좀 내에서 액틴 재배열과 박테리아 내재화로 이어집니다.

배양 후, 커버슬립을 완충액으로 세척하여 내재화되지 않은 박테리아를 제거합니다.

세포 구조를 보존하기 위해 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 세포내 표적에 접근하기 위해 비이온성 세제로 세포를 투과화합니다.

액틴 필라멘트에 결합하는 형광 표지된 팔로이딘을 추가합니다.

DNA를 염색하는 DAPI가 포함된 설치 매체 위에 커버슬립을 놓습니다.

형광 액틴으로 내피 세포 내의 형광 Porphyromonas gingivalis를 관찰하여 박테리아 내재화를 확인합니다.

내재화된 박테리아를 시각화하려면 먼저 12웰 플레이트의 각 웰 내부에 고압멸균된 유리 커버슬립을 무균 방식으로 옮깁니다. 커버슬립의 웰당 4개의 HUVEC에 10번 5회 도금하고 24시간 동안 배양합니다. 박테리아를 라벨링하려면 중간 로그상 박테리아를 원심분리하고 혐기성 PBS로 펠릿을 재현탁합니다. 다시 원심분리하고 세척 단계를 반복합니다.

20마이크로리터의 0.2밀리몰 BCECF-AM을 밀리리터당 5-7배 10에서 8번째 박테리아를 함유한 혐기성 PBS 2밀리리터에 첨가합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

우리가 사용하는 형광 염료는 대부분의 혐기성 박테리아를 염색할 수 있습니다. 따라서 특정 항체와 같은 다른 시약이 필요하지 않습니다.

박테리아 현탁액을 5,000배 g으로 10분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 라벨링 시약을 제거하고 박테리아를 VEGF 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 HUVEC 세포를 100:1의 비율로, 박테리아와 세포를 감염시키고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 감염 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 혐기성 챔