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Streptococcus pneumoniae 현탁액이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
박테리아 표면 항원과 상호 작용하는 박테리아 표면 항원 표적 항체를 도입합니다. 이것은 박테리아를 항체로 코팅하여 면역 인식을 위한 옵소화된 박테리아를 형성합니다.
보체 단백질을 함유한 토끼 혈청으로 보충된 인간 말초 혈액 림프구 유래 호중구로 우물을 파종합니다.
배양하는 동안 C3b와 같은 보체 단백질이 박테리아 표면에 침착되어 항체 옵소니화된 박테리아에 추가 옵소닌 코팅이 발생하여 호중구에 의한 박테리아 인식이 향상됩니다.
호중구의 특정 표면 수용체는 박테리아의 옵소닌과 상호 작용하여 식균 작용을 통해 박테리아의 삼킴을 촉진합니다.
식체 내부에서 호중구는 삼켜진 박테리아를 분해하여 완충액의 박테리아 수를 감소시킵니다.
배양 후, 희석된 공동 배양 용액을 혈액 한천 플레이트에 올려 개별 박테리아가 콜로니를 형성할 수 있도록 합니다.
옵소닌 처리된 박테리아의 콜로니 수를 처리되지 않은 박테리아와 비교합니다.
옵소닌 처리를 받은 콜로니가 적을수록 박테리아 사멸이 더 높다는 것을 나타내며, 이는 성공적인 옵소노포구 사멸을 시사합니다.
박테리아 스톡 튜브 한 개를 해동합니다. 박테리아를 6,000배 g으로 2분 동안 펠릿화하고, 이전 단계에서 얻은 최적의 희석액으로 세포 펠릿을 OBB에 재현탁합니다. 둥근 바닥 96웰 세포 배양 플레이트에서 웰당 재현탁된 박테리아 희석액 10마이크로리터를 피펫팅합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 적절한 항체 또는 약물 처리제를 각 실험 웰에 이중으로 추가합니다.
대조군 웰의 경우 처리 웰에 사용되는 완충액에 따라 1X PBS 또는 OBB를 사용합니다. 샘플 플레이트를 실온에서 약 90RPM으로 1시간 동안 흔듭니다.
3일 전에 DMF로 처리된 HL60 분화 세포를 수확하려면 세포를 500배 g으로 3분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 최소 10밀리리터의 1XPBS로 펠릿을 세척합니다. 세척된 세포를 500배 g으로 3분 동안 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 세포를 OBB에 재현탁합니다.
멸균된 희석되지 않은 아기 토끼 세럼을 최종 1-5 부피로 추가합니다. 1시간 박테리아 배양 후, 각 샘플을 두 그룹에 대해 중복 웰로 나눕니다. 다음으로, HL60 보체 혼합물 50마이크로리터를 각 실험 웰 세트에 추가하고 50마이크로리터의 OBB를 박테리아 웰에만 추가합니다. 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔듭니다.
샘플을 도금하려면 각 웰을 OBB로 1-5 최종 부피로 희석하여 각 샘플의 부피가 50마이크로리터 이상이되도록 합니다. 다음으로, 각 샘플 50마이크로리터를 박테리아 배양 플레이트의 지정된 영역에 직접 피펫팅하여 샘플 사이에 적절한 간격을 둡니다. 뚜껑을 덮고 실온에서 약 15분 동안 샘플을 건조시킵니다.
접시를 뒤집고 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 또는 혐기성 항아리에 배양 플레이트를 넣어 무산소 조건이 박테리아 성장에 영향을 미치는지 테스트하거나 형태를 제어합니다. 하룻밤 배양 후, 지정된 각 샘플 영역의 콜로니 수를 계산하고 각 세트의 살아있는 세포 수를 해당 대조군과 비교하여 데이터 분석을 진행합니다.
이 기술을 처음으로 확립하는 데 있어 가장 어려운 측면은 박테리아 스톡의 시작 CFU를 최적화하고 HL60 세포가 효과적으로 분화되도록 하는 것일 것입니다.