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형광 표지된 세포질 단백질로 암세포를 배양합니다.
항종양 활성을 갖는 사이토카인 유도 킬러 또는 CIK 세포(자연 살해 세포와 유사한 특성을 가진 이펙터 T 세포)를 추가합니다.
CIK 세포의 자연 살해 그룹 2 구성원 D 또는 NKG2D 수용체는 암세포의 스트레스 유도 단백질에 결합합니다.
결합은 CIK 세포가 세포질 과립 독소(퍼포린 및 그란자임)를 방출하도록 유도합니다.
퍼포린은 암세포막에 기공을 형성하여 카스파제를 활성화하여 세포사멸을 유도하는 그란자임의 유입을 허용합니다.
배양 후 세포를 수확합니다. 형광 핵산 결합 세포 생존율 염료를 첨가합니다.
염료는 손상된 세포막을 통해 들어가 DNA에 결합하여 이중 염색된 죽은 세포를 생성합니다.
온전한 세포막으로 살아있는 세포는 염료에 불투과합니다.
세포를 유세포 분석기를 통해 단일 형광을 나타내는 살아있는 세포와 이중 형광을 나타내는 죽은 세포를 검출합니다.
산점도를 생성하여 죽은 암세포의 비율을 측정하여 CIK 세포의 세포독성 효과를 정량화합니다.
세포독성 분석을 수행하기 위해 1밀리리터의 K562 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 밀리리터당 50만 개의 세포 밀도로 추가하여 CIK와 인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포를 공동 배양합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 CIK 세포가 있거나 없는 기저 배지 1밀리리터를 6웰 플레이트에 추가합니다. 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 최소 3회 혼합합니다.
플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다. 이제 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 CIK 세포가 있거나 없는 기저 배지 1밀리리터를 6웰 플레이트에 추가하여 CIK와 난소 OC-3 세포를 공동 배양합니다. 인큐베이터에서 24시간 동안 블레이드를 사용하여 최소 3회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 배양 후, CIK-K562 세포 현탁액을 15밀리리터 멸균 튜브에 직접 수확합니다.
CIK-OC-3 그룹에서 현탁액 및 부착 세포를 모두 수확하려면 먼저 세포 현탁액을 15밀리리터 멸균 튜브로 옮깁니다. 멸균 PBS 1밀리리터로 우물을 세척합니다. PBS를 수집하여 튜브에 추가합니다. 그런 다음 0.5밀리리터의 세포 해리 효소 용액을 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.
동일한 튜브에서 해당 웰에 용액 1밀리리터를 추가하고 1밀리리터 멸균 피펫으로 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 세포를 부드럽게 혼합합니다. 같은 튜브에 모든 세포를 모으십시오. 300 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포를 멸균 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 세포를 300 x g으로 10분 동안 펠릿화합니다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 세포를 100마이크로리터의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
세포 현탁액에 5마이크로리터의 7-AAD 염료를 첨가합니다. 1밀리리터 멸균 피펫으로 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 세포를 부드럽게 혼합합니다. 10분 동안 배양하고 분석하기 전에 어둡게 두십시오.
세포 용해 능력 분석을 수행하려면 세포 현탁액을 혼합하고 유세포 분석을 위한 준비를 반복합니다. 새 표본 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 튜브의 이름을 지정합니다.
세포용해 분석을 위한 산란 게이팅 시스템을 생성하려면 먼저 튜브 1을 선택하고 도트 플롯 버튼을 클릭합니다. FSC-A/SSC-A 플롯을 생성하려면 FSC-A 임계값이 50,000보다 큰 모든 이벤트에 직사각형 게이트를 그려 세포 파편을 배제합니다. 새 도트 플롯에 대한 SSC-A/CFSE 매개변수를 선택합니다. 그런 다음 새 도트 플롯에 대해 7-AAD/CFSE 매개변수를 선택하고 4사분면 게이트를 그려 4개의 하위 모집단을 정의합니다.
Load Sample(샘플 로드) 버튼을 클릭하여 빈 대조군 샘플을 먼저 분석합니다. SSC-A 및 FSC-A의 전압을 조정합니다. CFSE 및 7-AAD 채널 매개변수를 사용하여 죽은 세포 집단을 식별합니다. 각 표본에서 20,000개 이상의 CFSE 양성 세포의 데이터를 기록합니다. 각 개별 표본의 통계 값이 포함된 파일을 열어 생존 불가능한 세포 집단을 분석하고 데이터를 분석 파일로 내보냅니다.