암세포가 호중구 세포외 트랩에 부착되는 것을 감지하기 위한 In vitro adhesion assay

암 미세 환경에서 활성화된 호중구는 암 진행에 중요한 역할을 하는 세포외 DNA 섬유, 히스톤 및 과립 단백질로 구성된 호중구 세포외 트랩(NET)을 방출합니다.

시험관 내에서 암세포-NET 접착을 연구하려면 멀티웰 플레이트 웰에 NET 현탁액을 첨가하십시오. NET 단층 형성을 위해 배양합니다.

배양 후, 부착되지 않은 NET을 제거합니다.

웰의 자유 결합 부위를 차단하기 위해 단백질 용액을 추가합니다.

NET 단층 위에 형광 표지 암세포를 피펫팅합니다.

암세포의 특정 표면 수용체는 NET과 상호 작용하여 세포 접착을 촉진합니다.

배양 후 음성 대조군 웰에서 배지를 버립니다.

데옥시리보뉴클레아제를 첨가하여 NET을 분해하여 세포를 분리합니다.

음성 대조군 및 테스트 웰에서 용액을 제거합니다. 완충액을 사용하여 비부착 세포를 제거합니다.

부착된 암세포를 포름알데히드로 NET에 고정합니다.

형광 현미경을 사용하여 NET에 부착된 형광 암세포를 시각화합니다.

테스트 웰은 NET에 대한 상당한 암세포 부착을 보여주는 반면, 데옥시리보뉴클레아제 처리된 NET은 감소된 수준의 암세포 부착을 나타냅니다.

96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 NET 스톡을 추가하고 어둠 속에서 서운 곳에서 밤새 플레이트를 배양하여 웰을 코팅합니다. 12-20시간 후, 현미경을 사용하여 웰 바닥에 무세포 NET 의 균일한 단층이 형성되었는지 확인합니다. 단층이 확인되면 바닥의 단층을 방해하지 않도록 모든 비접착 물질을 웰 밖으로 부드럽게 흡인합니다.

이것이 이 절차에서 가장 어려운 측면입니다. 적절한 NET 단층을 유지하려면 플레이트를 매우 조심스럽게 다루어야 합니다. 웰 측면에 모든 시약과 세포를 천천히 추가합니다. 매우 부드럽게 흡인하고 흡입 팁으로 우물 바닥에 닿지 않도록 하십시오.

비접착 물질을 제거한 상태에서 100마이크로리터의 1% 소 혈청 알부민 차단 용액을 각 웰에 부드럽게 첨가하고 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 플레이트를 휘젓거나 흔들면 NET 단층이 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오.

다음으로, 표준 기술을 사용하여 A549 암세포가 70-80% 합류할 때 수확하여 A549 암세포를 준비합니다. 100마이크로리터당 2 x 10⁴ 세포의 농도로 배지에 세포를 재현탁합니다. 배지 밀리리터당 1마이크로리터의 CFSE를 첨가하여 세포를 염색하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.

다음으로, 세포를