JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 3:40 분 • July 8th, 2025
사이토카인과 같은 자극 인자가 없는 성장 배지에 백혈병 세포를 채취하여 배양합니다.
자극 인자가 없기 때문에 세포 내 인산화 단백질이 탈인산화를 거쳐 원래 상태로 돌아갈 수 있습니다.
원심분리하여 배지를 제거합니다. 사이토카인, 흉선 간질 림프포이에틴 또는 TSLP를 포함하는 간질 상청액에 세포를 재현탁합니다.
TSLP는 백혈병 세포의 수용체에 결합하여 수용체 이량체화를 유발합니다.
이것은 두 개의 Janus 관련 키나아제 또는 JAK를 더 가깝게 만들어 상호 트랜스포스포리화를 촉진합니다.
활성화된 JAK는 수용체의 세포질 꼬리를 인산화하여 신호 변환기 및 전사 활성화제인 STAT 단량체를 위한 도킹 부위를 생성합니다.
일단 인산화되면 STAT는 이량체화되어 수용체에서 분리되어 다운스트림 세포 과정을 조절합니다.
세포내 단백질의 인산화 상태를 유지하기 위해 세포를 고정합니다.
세포막 투과성을 높이기 위해 투과성 용액으로 세포를 처리합니다.
형광 표지된 항체를 첨가하여 인산화된 단백질을 표지합니다.
형광 신호의 유세포 분석법 측정은 TSLP 유도 STAT 인산화와 상관관계가 있습니다.
조작된 간질에서 생성된 상청액을 검증하기 위해, 사이토카인 발현 간질에서 대조군으로부터 수확한 상청액 샘플을 해동하고, R20 배지에서 조건당 백혈병 세포주 3웰을 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 2배 10 내지 5번째 세포로 플레이트합니다. 세포를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 이전 배양의 인산화가 손실
되도록 합니다.그런 다음 각 웰의 세포를 개별 4밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠릿을 실험 조건당 600마이크로리터에 재현탁하고, 각 조건에 대해 웰당 200마이크로리터의 세포를 세 번씩 플레이트합니다. 특정 상업용 인광 분석에 따라 적절한 기간 동안 세포를 배양합니다.
배양이 끝나면 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 제조업체의 프로토콜에 따라 인류 세포 분석 염색을 통해 세포를 라벨링합니다. 그런 다음 표준 유세포 분석 프로토콜을 사용하여 유세포 분석으로 세포를 분석하여 간질 상청액의 사이토카인이 백혈병 세포를 인산화하는지 확인합니다.