0 조회수 • 3:54 분 • July 8th, 2025
Jurkat 세포(T 림프구 백혈병 세포)의 현탁액을 섭취하십시오.
분취량을 세포 생존율 염료와 혼합하고 적절한 수의 살아있는 세포를 확보합니다.
배양 접시에 세포를 도금하고 필요한 시간 동안 자외선 C 또는 UVC, 방사선을 적용합니다.
UVC는 세포에 침투하여 DNA에 흡수되어 피리미딘 광산물을 형성합니다.
조사 후 세포를 배양합니다. 광범위한 UVC 매개 DNA 손상은 내재적 세포사멸 경로를 시작하여 외부 미토콘드리아 막의 세포사멸 촉진 단백질을 활성화합니다.
활성화된 단백질은 올리고머화되어 막 기공을 형성하고 막간 공간에서 세포질로 시토크롬 C를 방출합니다.
시토크롬 C는 세포사멸 프로테아제 활성화 인자-1과 복합체를 형성하여 아포토솜 복합체를 형성합니다. 아세포토좀은 카스파제를 활성화하여 세포사멸을 일으킵니다.
형광단 표지 아넥신 V를 도입하여 세포사멸 세포 마커인 멤브레인에 포스파티딜세린을 표지하고, 손상된 멤브레인을 통해 들어가 DNA를 표지하는 요오드화 프로피듐을 첨가합니다.
유세포 분석을 사용하여 아넥신 V 표지 초기 세포사멸 세포와 이중 염색 후기 세포사멸 세포를 결정합니다.
원고 지침에 따라 보충된 기저 세포 배양 배지에서 Jurkat T 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양하는 것으로 시작합니다. Jurkat T 세포는 3일마다 예열된 배양 배지로 계대하여 유지될 수 있는 현탁 세포주입니다.
세포사멸 세포를 90% 컨플루시티까지 성장시켜 준비하며, 이는 계대 후 3-4일이 소요됩니다. 이 프로토콜에 충분한 수의 세포를 얻기 위해 5개의 T75 플라스크에서 세포를 성장시킵니다. 세포가 준비되면 플라스크 내용물을 약 24밀리리터 흡인하고 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 트리판 블루 염색과 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
5분 동안 271배 g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상청액을 버립니다. 그런 다음 세포를 배지에 재현탁하여 밀리리터당 300만 개의 세포를 얻습니다. 접시당 5밀리리터의 세포를 옮겨 세포를 100 x 20mm 조직 배양 접시에 분취합니다.
약 9개의 배양 접시를 준비합니다. 접시 하나를 노출되지 않은 대조군으로 따로 보관하고 나머지 접시는 UV에 노출시킵니다. 에너지 버튼을 누르고 숫자 패드로 "600"을 입력하여 UV 가교제를 올바른 에너지 수준으로 설정합니다. 대조군을 제외한 모든 접시에 세포를 조사하고 UV 노출 중에 조직 배양 접시의 상단 덮개를 제거해야 합니다.
그런 다음 모든 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 세포 배양기에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 조사된 모든 세포를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 결합하고 5분 동안 271배 g에서 원심분리하여 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 세포를 멸균 PBS 24밀리리터에 재현탁합니다. 튜브를 다시 원심분리하고 상청액을 제거합니다.