유세포 분석을 사용한 테스트 알레르겐이 있는 상태에서 호염병 활성화 분석

자극 완충액에 현탁된 형광 표지 단클론 항체를 포함하는 염색 혼합물을 포함하는 세포 분석기 튜브를 가져 와십시오.

감소

하는 농도의 테스트 알레르겐을 여러 튜브에 추가합니다. 항-IgE 항체를 한 튜브에 추가하여 IgE 매개 양성 대조군 역할을 하고, 음성 대조군을 위해 다른 튜브에 완충액을 추가합니다.

인간의 말초 혈액을 튜브에 피펫팅합니다. 인큐베이트.

개인이 테스트 알레르겐에 감작되는 경우, 이러한 노출로 인해 알레르겐은 호염기구 표면의 Fc 수용체에 결합된 알레르겐 특이적 IgE 항체에 결합하게 됩니다.

알레르겐은 IgE 결합 Fc 수용체를 가교하여 호염기구 활성화를 유발합니다.

호염기구는 탈과립을 거쳐 염증 매개체를 포함하는 세포내 과립을 방출하고 CD63 및 CD203c 분자의 상향 조절

을 합니다.

형광 표지된 단클론 항체는 호염기구에서 각각 CD63, CD203c 및 CCR3에 결합합니다.

호

염기구 탈과립을 멈추기 위해 온도를 낮춥니다.

완충액을 첨가하여 적혈구를 용해하고 세포를 고정합니다.

유세포 분석기를 사용하여 림프구 집단에서 호염기구를 식별합니다.

CD63을 활성화 마커로 사용하여 알레르겐 농도 감소에서 호염기구 활성화를 분석합니다.

9밀리리터 헤파린 처리 튜브에 말초 혈액을 채취하는 것으로 시작하고 샘플을 로터에 넣어 실험 프로토콜에 필요할 때까지 실온을 유지합니다.

음성 대조군과 양성 대조군을 위해 각각 2개의 5밀리리터 세포 분석기 튜브에 라벨을 붙입니다. 또한 테스트 중인 다양한 알레르겐 또는 약물 농도에 대해 각각 하나의 튜브에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 튜브가 미끄러지지 않고 완벽하게 맞도록 튜브를 랙에 놓습니다.

첫 번째 양성 대조군의 경우, 호염기구의 품질을 확인하기 위해 0.05% PBST에 N-포밀메티오닐-류실-페닐알라닌 또는 fMLP의 4마이크로몰 용액을 준비합니다. 두 번째 양성 대조군의 경우 PBST를 사용하여 밀리리터당 0.05mg의 항IgE 용액을 준비합니다. 자극 완충액 20마이크로리터당 CCR3-APC, CD203c-PE 및 CD63-FITC 항체를 각각 1마이크로리터씩 첨가하여 염색 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 이 염색 혼합물 23마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.

음성 대조군 튜브에 100마이크로리터의 PBST를 추가하고, 양성 대조군 튜브 중 하나에 100마이크로리터의 fMLP를 추가하고, 다른 튜브에 100마이크로리터의 항-IgE를 추가합니다. 나머