지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

인지질과 비오틴화된 인지질로 구성된 지지된 지질 이중층(SLB)이 있는 챔버 슬라이드를 준비합니다.

비특이적 상호 작용을 방지하기 위해 차단 단백질을 추가합니다.

비오틴화된 인지질에 결합하는 스트렙타비딘을 소개합니다.

고정화된 스트렙타비딘에 결합하는 비오티닐화된 형광 표지 항-CD16 항체를 추가합니다.

D-비오틴을 피펫팅하여 스트렙타비딘이 세포에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다.

자연 살해 또는 NK 세포를 도입합니다. 이들 세포의 CD16 수용체는 SLB 결합 항-CD16 항체에 특이적으로 결합하여 면역학적 시냅스를 형성합니다.

이 결합은 액틴 재배열과 미세소관 분극을 유발하여 결국 SLB 결합 항-CD16 항체 및 CD16 수용체를 포함하는 시냅스 중심에 미세클러스터를 형성합니다.

퍼포린을 함유한 용해성 과립은 시냅스에서 액틴 필라멘트를 통해 분극되어 침투합니다.

세포를 수정합니다. 멤브레인과 SLB를 투과화합니다.

각 액틴 필라멘트와 퍼포린에 결합하는 형광 표지된 팔로이딘 및 항-퍼포린 항체를 추가합니다.

초고해상도 형광 현미경을 사용하여 시냅스에서 형광 액틴 필라멘트와 퍼포린 양성 과립의 분포를 시각화합니다.

유리 지지 평면 지질 이중층을 조립하려면 먼저 비커에 30% 과산화수소와 황산을 1:3의 비율로 혼합하여 피라냐 용액 100ml를 준비합니다. 이 용액에 직사각형 #1.5 커버슬립 20-30분 동안 놓습니다. 커버슬립을 청소하는 동안 이전에 준비된 400마이크로몰 DOPC 지질 튜브 1개와 이전에 준비된 80마이크로몰 비오틴-PE 지질 튜브 1개를 회수합니다. 얼음 위에서 아르곤 탱크로 운반하십시오.

새로운 미세 원심분리기 튜브를 아르곤으로 탈산소화한 후 DOPC와 비오틴-PE를 1:1 비율로 함께 첨가합니다. 특정 부피는 실험적 필요에 따라 다르지만 각각 최소 2마이크로리터여야 합니다. 혼합 튜브와 개별 시약 튜브를 냉장고로 되돌리기 전에 탈산소화하십시오.

청소가 끝나면 증류수로 커버슬립을 철저히 헹굽니다. 커버슬립을 몇 분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 1.5마이크로리터의 리포좀 혼합물을 빼내고 챔버 슬라이드의 레인 챔버 중 하나에 한 방울로 분취합니다. 차선당 두 개의 드롭을 사용하는 것이 일반적이지만 필수는 아닙니다.

이제 물방울 위에 마른 커버슬립을 빠르고 효율적으로 놓습니다. 커버슬립을 놓은 후 물방울이 합쳐지지 않도록 방울이 충분한 간격을 두었는지 확인하십시오. 또한 방울이 챔버 벽의 가장자리에 닿지 않고 원형이고 잘 정의되어 있는지 확인하십시오. 커버슬립과 슬라이드 사이의 방수 밀봉을 보장하기 위해 각 레인 사이와 주변을 세게 누릅니다.

마커 펜을 사용하여 방울의 위치를 표시하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 5% 카제인 수성을 챔버에 통과시켜 이중층을 차단합니다. 플로우 챔버에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 밀리리터당 333나노그램 농도의 스트렙타비딘 100마이크로리터를 각 레인에 주입합니다.

실온에서 10 내지 15분 동안 배양한 후, 과도한 스트렙타비딘을 제거하기 위해 각 레인을 통해 1% 인간 혈청 알부민과 함께 HEPES 완충 식염수 3밀리리터를 실행하여 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 결정된 단백질 농도에서 100마이크로리터의 비오티닐화, 형광 표지된 항-CD16을 추가합니다.

두운 곳에서 20-30분 동안 배양한 후, 각 레인을 통해 1% 인간 혈청 알부민과 함께 HEPES 완충 식염수 3밀리리터를 실행하여 다시 세척합니다. 그런 다음 과도한 스트렙타비딘에 결합하기 위해 25나노몰의 농도로 100마이크로리터의 D D-비오틴을 챔버를 통해 흐르게 하여 스트렙타비딘이 세포에 비특이적으로 결합할 가능성을 제거합니다.

다음으로, 인간 NK 세포를 계수하고 1% 인간 혈청 알부민이 포함된 HEPES 완충 식염수에 밀리리터당 500,000의 농도로 재현탁합니다. 레인당 1% 인간 혈청 알부민이 함유된 HEPES 완충 식염수 3밀리리터로 D-비오틴을 챔버 밖으로 씻어냅니다. 세포가 원하는 농도로 재현탁되면 각 레인에 100마이크로리터를 추가합니다. 챔버를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 30-60분 동안 넣습니다.

이 배양 기간 후, 실온에서 10-20분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 파라포름알데히드를 제거하기 위해 각 레인을 통해 인산염 완충 식염수 3밀리리터를 흐르게 하여 세척합니다. 그런 다음 실온에서 30분 동안 배양하기 전에 400마이크로리터의 차단 완충액을 추가합니다.

다음으로, 희석된 형광 표지 팔로이딘 및 형광 표지 항-퍼포린 단클론 항체 200마이크로리터를 첨가하여 F-액틴과 퍼포린을 염색합니다. 챔버를 통해 3밀리리터의 인산염 완충 식염수를 흐르게 하여 세척하기 전에 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 챔버는 이미징 준비가 되었습니다.

시작하려면 STED 현미경의 필요한 모든 하드웨어 모듈을 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어를 시작하고 공진 스캐닝 및 STED 모듈을 모두 활성화합니다. 이러한 선택을 한 후 소프트웨어가 시작될 때까지 약 3-5분 정도 기다리십시오.

화면 상단의 구성 탭을 클릭합니다. 레이저 구성을 선택합니다. 그런 다음 백색광과 STED 592나노미터 레이저를 켭니다. 100X 대물렌즈를 선택하고 여기 레이저 빔을 592나노미터 공핍 레이저와 정렬합니다. 레이저 구성 모듈을 선택합니다. 592 공핍 레이저를 끄고 660 나노미터 공핍 레이저를 켭니다.

슬라이드를 무대 렌즈 위에 놓습니다. 경계된 이중층 영역에 결합된 세포에 초점을 맞추십시오 백색광 램프와 안경을 사용합니다. 그런 다음 구성 탭 바로 오른쪽에 있는 획득 탭으로 돌아갑니다. 백색광으로 전환 탭을 클릭한 다음 해당 모듈을 켜고 여기 레이저 라인을 적절한 파장으로 드래그합니다.

원하는 검출기를 선택하고 검출 범위를 설정한 후 왼쪽 획득 도구 모음에서 순차 버튼을 클릭하여 왼쪽 도구 모음 하단에 순차 스캐닝 대화 상자를 불러옵니다. 이를 통해 사용자는 여러 시퀀스를 추가할 수 있으며, 각각 다른 색상에 대해 다른 흥분 빔을 가질 수 있습니다. 프레임 사이를 클릭한 다음 각 추가 색상에 대한 여기 주파수, 검출기 및 감지 범위를 설정합니다. 모든 설정이 최적화되면 시작을 눌러 획득 프로세스를 시작합니다.