JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 7:53 분 • July 8th, 2025
인지질과 비오틴화된 인지질로 구성된 지지된 지질 이중층(SLB)이 있는 챔버 슬라이드를 준비합니다.
비특이적 상호 작용을 방지하기 위해 차단 단백질을 추가합니다.
비오틴화된 인지질에 결합하는 스트렙타비딘을 소개합니다.
고정화된 스트렙타비딘에 결합하는 비오티닐화된 형광 표지 항-CD16 항체를 추가합니다.
D-비오틴을 피펫팅하여 스트렙타비딘이 세포에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다.
자연 살해 또는 NK 세포를 도입합니다. 이들 세포의 CD16 수용체는 SLB 결합 항-CD16 항체에 특이적으로 결합하여 면역학적 시냅스를 형성합니다.
이 결합은 액틴 재배열과 미세소관 분극을 유발하여 결국 SLB 결합 항-CD16 항체 및 CD16 수용체를 포함하는 시냅스 중심에 미세클러스터를 형성합니다.
퍼포린을 함유한 용해성 과립은 시냅스에서 액틴 필라멘트를 통해 분극되어 침투합니다.
세포를 수정합니다. 멤브레인과 SLB를 투과화합니다.
각각 액틴 필라멘트와 퍼포린에 결합하는 형광 표지된 팔로이딘 및 항-퍼포린 항체를 추가합니다.
초고해상도 형광 현미경을 사용하여 시냅스에서 형광 액틴 필라멘트와 퍼포린 양성 과립의 분포를 시각화합니다.
유리 지지 평면 지질 이중층을 조립하려면 먼저 비커에 30% 과산화수소와 황산을 1:3의 비율로 혼합하여 피라냐 용액 100ml를 준비합니다. 이 용액에 직사각형 #1.5 커버슬립 20-30분 동안 놓습니다. 커버슬립을 청소하는 동안 이전에 준비된 400마이크로몰 DOPC 지질 튜브 1개와 이전에 준비된 80마이크로몰 비오틴-PE 지질 튜브 1개를 회수합니다. 얼음 위에서 아르곤 탱크로 운반하십시오.
새로운 미세 원심분리기 튜브를 아르곤으로 탈산소화한 후 DOPC와 비오틴-PE를 1:1 비율로 함께 첨가합니다. 특정 부피는 실험적 필요에 따라 다르지만 각각 최소 2마이크로리터여야 합니다. 혼합 튜브와 개별 시약 튜브를 냉장고로 되돌리기 전에 탈산소화하십시오.
청소가 끝나면 증류수로 커버슬립을 철저히 헹굽니다. 커버슬립을 몇 분 동안 자연 건조시킵니다. 그런 다음 1.5마이크로리터의 리포좀 혼합물을 빼내고 챔버 슬라이드의 레인 챔버 중 하나에 한 방울로 분취합니다. 차선당 두 개의 드롭을 사용하는 것이 일반적이지만 필수는 아닙니다.
이제 물방울 위에 마른 커버슬립을 빠르고 효율적으로 놓습니다. 커버슬립을 놓은 후 물방울이 합쳐지지 않도록 방울이 충분한 간격을 두었는지 확인하십시오. 또한 방울
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