JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 3:34 분 • July 8th, 2025
비만 세포(염증 매개체를 포함하는 분비 과립이 있는 면역 세포 또는 SG)가 들어 있는 챔버 커버글라스를 가져 가십시오.
pH에 민감한 형광 리포터와 함께 IgE 항체를 첨가하고 배양합니다.
항체는 비만 세포의 Fc 수용체에 결합합니다. 기포체는 소식작용을 통해 내면화되고 생성된 엔도좀은 SG와 융합됩니다.
미디어를 제거합니다. 다수의 IgE-결합 에피토프를 포함하는 항원을 추가하고; 슬라이드를 형광 현미경 아래에 놓고 필요한 여기 파장을 적용합니다.
SG의 산성 pH는 리포터 형광을 소멸시킵니다.
항원은 세포 표면의 IgE 수용체 복합체에 결합하여 가교합니다.
항원 매개 수용체 응집은 SG가 원형질막을 향해 이동하도록 유발합니다.
혈장 및 SG 막의 SNARE 단백질은 막 융합 및 엑소사이토시스라고 하는 SG 화물의 배출을 매개합니다.
배지의 pH가 높을수록 SG 알칼리화가 발생하여 리포터가 형광을 회복하도록 유도합니다.
들어오는 SG는 멤브레인 융합 SG와 융합됩니다. 두 번째 SG의 알칼리화는 형광 회복을 매개하여 복합 엑소사이토시스를 확인합니다.
10마이크로리터의 세포 현탁액을 신선한 FITC-덱스트란 보충 배양 배지가 있는 챔버 커버글라스에 첨가하고 밤새 RBL 세포를 성장시킵니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 최종 Tyrode의 완충 용액을 준비합니다. 그런 다음 새로 만든 완충액에 20x 분비촉진제 시약을 준비합니다.
염화암모늄 분말을 Tyrode의 완충액에 용해시켜 400밀리몰 염화암모늄 용액을 만듭니다. 다음으로, 챔버가 있는 커버 유리에서 배지를 흡인하고 300마이크로리터의 예열된 Tyrode's 완충액으로 교체합니다. 세척 과정을 두 번 반복한 후 챔버에 300마이크로리터의 Tyrode 완충액을 보충합니다.
그런 다음 챔버가 있는 커버글라스를 현미경의 인큐베이터 챔버에 놓고 챔버가 안정적인지 확인합니다. 형광등을 켜고 적절한 형광 필터를 선택합니다. 관심 영역이 시야 중앙에 초점이 맞으면 광원을 끕니다.
그런 다음 방출이 약 500-550나노미터로 수집된 488나노미터 레이저를 켭니다. 다음으로, 이미지 획득 사이의 시간 간격을 보정합니다. 스캔 방향을 "양방향"으로 설정합니다. 평균화를 허용하지 마십시오. 핀홀을 열고 해상도를 512 x 512로 설정합니다.
다음으로, 특정 세포 유형 또는 분비 촉진제에 대해 적절한 기간 동안 세포를 이미지화합니다. 그런 다음 분비촉진제 용액에서 16마이크로리터를 챔버에 넣고 촬영을 계속합니다. 마지막으로, 분비 과립에 대한 FITC-덱스트란의 존재 및 국소화를 확인하기 위해 16마이크로리터의 염화암모늄 용액을 챔버에 부드럽게 첨가합니다.