진균 병원체에 감염된 제브라피시 유충을 시각화하기 위한 zWEDGI 기법

정확한 추적을 위해 고유한 형광 마커로 태그가 지정된 형광 표지 면역 세포를 발현하는 형질전환 제브라피쉬 유충으로 시작합니다.

유충은 후뇌에 Aspergillus 포자를 발현하는 적색 형광 단백질을 미리 주입합니다.

후뇌 내에서 곰팡이 포자는 국소 염증을 모방하고 포자를 제거하기 위해 포자를 식균하는 대식세포를 포함한 면역 세포를 유인합니다.

소수의 포자가 지속되어 균사로 발아하는 동안 병원체 유래 분자를 방출하고 호중구를 감염 부위로 유인합니다.

마취된 유충을 성장 및 이미징을 위한 제브라피쉬 상처 및 포획 장치 또는 제한 채널을 통해 상처 챔버에 상호 연결된 zWEDGI 장치의 배지 함유 로딩 챔버로 옮깁니다.

후뇌 이미징을 위해 등쪽-측면 방향으로 제한 채널 내에 유충을 고정합니다.

초기 단계에서 적색 형광은 진균 포자를 나타내고 녹색 형광은 감염 부위에 대한 대식세포 모집을 확인합니다.

시간이 지남에 따라 적색 형광의 확산은 감염 진행을 의미하는 반면, 추가 청색 형광의 출현은 호중구 모집을 나타냅니다.

이미징 당일, 100마이크로몰 PTU가 포함된 3.5mm 페트리 접시 1개와 E3-트리카인이 포함된 페트리 접시 1개를 준비합니다. ZWEDGI 장치의 챔버에 E3-트리카인을 추가하고 P100 마이크로피펫을 사용하여 챔버와 구속 채널에서 기포를 제거한 다음 챔버 외부의 과도한 E3-트리카인을 모두 제거합니다.

유충 한 마리를 피펫팅하여 E3 PTU로 접시로 옮긴 다음 가능한 한 적은 액체로 E3-트리카인으로 옮깁니다. 30초 후 마취된 유충을 상처 및 포획 장치의 로딩 챔버로 옮깁니다.

상처 챔버에서 E3-트리카인을 제거하고 유충의 꼬리를 제한 채널로 이동시키기 위해 로딩 챔버로 방출합니다. 유충이 측면, 등쪽 또는 배외측에 위치하여 후뇌를 거꾸로 대품 렌즈로 이미지화할 수 있도록 하십시오.

공초점 현미경으로 유충을 영상화한 후 E3-트리카인을 상처 챔버로 방출하여 유충을 구속 채널에서 로딩 챔버로 밀어 넣습니다. 유충을 집어 E3-트리카인으로 접시에 다시 옮긴 다음 가능한 한 적은 액체로 E3 PTU로 접시에 옮깁니다. PTU에서 헹구고 다시 48웰 플레이트로 옮깁니다.