안티 캡슐 항체에 의한 캡슐화된 박테리아의 옵소니화를 평가하기 위한 Opsono-Adherence Assay

화학적으로 사멸되고 형광 표지된 Bacillus anthracis의 현탁액을 섭취하십시오.

주로 폴리감마글루탐산으로 구성된 박테리아 캡슐은 식균 작용에 대한 보호 기능을 제공합니다.

보체 단백질을 파괴하기 위해 열비활성화된 인간이 아닌 영장류 혈청을 섭취하십시오. 박테리아 캡슐 기반 백신으로 면역된 동물로부터 분리된 이 혈청에는 항캡슐 항체가 포함되어 있습니다.

화학적으로 죽은 박테리아 현탁액을 혈청에 첨가합니다. 항체는 박테리아 캡슐에 특이적으로 결합하여 박테리아 옵소니제션을 촉진하고 식세포 세포에 의한 제거를 표시합니다. 옵소니제를 강화하기 위해 표준 보체 단백질을 첨가하십시오.

옵소화된 박테리아를 부착된 대식세포(식세포 세포)로 옮깁니다. 잠깐 인큐베이팅합니다.

박테리아의 항체와 보체 단백질은 각각 대식세포 Fc 수용체와 보체 수용체에 결합하여 박테리아 부착을 촉진합니다.

미디어를 제거합니다. 완충액으로 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거합니다.

세포 무결성을 보존하기 위해 세포를 고정하십시오.

형광 염색제를 사용하여 대식세포를 표지합니다.

형광현미경을 사용하여 형광이 다른 대식세포에 부착된 형광균을 관찰하여 항캡슐 항체에 의한 효과적인 박테리아 옵소닝을 확인합니다.

고정제를 제거하기 위해 비활성화된 박테리아 스톡을 PBS에서 세 번 세척합니다. 밀리리터당 75마이크로그램의 최종 농도로 FITC 용액을 첨가합니다. 섭씨 4도에서 18-24시간 동안 천천히 혼합물을 교반합니다. 과잉 FITC를 제거하기 위해 이전과 같이 박테리아를 씻으십시오.

최종 세척 후, 동일한 시작 부피의 PBS에 간균을 재현탁합니다. 간균을 분취하여 사용할 때까지 섭씨 -20도에서 보관하십시오. 인간이 아닌 영장류의 소량의 테스트 혈청을 열 블록 또는 PCR 기계에서 섭씨 56도에서 30분 동안 열 비활성화합니다. FITC 표지 박테리아를 PBS로 2회 해동하고 세척하여 15,000배 g으로 3-5분 동안 펠릿화합니다. 동일한 시작 볼륨의 PBS에서 재일시 중단합니다.

96웰 둥근 바닥 플레이트에서 세포 배지에서 테스트 혈청을 연속적으로 희석합니다. 또 다른 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 10마이크로리터의 희석된 테스트 혈청을 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 새로 재구성된 아기 토끼 보충제 10마이크로리터를 추가합니다.

플레이트 번호 3에 20의 감염 다중도에 대해 적절한 부피의 FITC 표지 간균을 추가하여, 예를 들어, 50,000 세포에 대해 50,000 x 20 간균을 포함하는 부피에서. 플레이트 번호 3의 각 웰을 총 105마이크로리터까지 적절한 부피의 세포 배지로 채웁니다. 3번 플레이트를 섭씨 37도에서 습도가 있는 5% CO2의 존재 하에서 30분 동안 배양하여 간균을 옵소니화합니다.

부착 세포가 포함된 플레이트 번호 1을 섭씨 37도의 열 블록에 놓습니다. 다중 채널 피퍼터를 사용하여 웰에서 사용한 배지를 제거하고 플레이트 번호 3에서 100마이크로리터의 옵소화 박테리아로 신속하게 교체하여 피펫팅 중에 웰에 기포가 생성되지 않도록 합니다. 세포 단층을 방해하지 않으려면 웰 측면에 부피를 추가하십시오.

을 위해 섭씨 37도에서 5% CO₂ 및 습도와 함께 30분 동안 플레이트 번호 1을 배양합니다. 부착되지 않은 간균을 제거하기 위해 섭씨 37도의 열 블록 위에 150마이크로리터의 PBS로 각 웰을 5회 세척합니다. 세척 중에 세포가 실수로 분산되지 않도록 웰 옆으로 피펫팅합니다. 각 웰에 150마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 넣고 세포를 1시간 동안 고정합니다.

PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 2마이크로리터의 고함량 스크리닝 주황색 세포 염색을 10밀리리터의 PBS에 혼합합니다. 그런 다음 이 염색 용액 150마이크로리터를 고정 세포에 첨가하고 주변 온도에서 30분 동안 배양합니다. 스테이지에 플레이트 1번을 놓고 명시야 또는 위상차를 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.

획득 탭에서 플레이트 설정으로 96웰 형식을 선택한 다음 채널 설정을 선택합니다. 그런 다음 타일 모드로 설정을 선택합니다. 획득할 이미지 수를 나타냅니다. 획득 모드를 흑 백 또는 흑백으로 변경하고 비닝을 최소 2 x 2로 설정합니다. 자동 초점 또는 초점 모듈을 켭니다. 자동 초점 기능을 얼마나 자주 수행하는지 나타냅니다.

다음으로, 가능한 경우 z-스택 기능을 켜서 세포 단층과 부착된 간균의 두께를 포착할 z-스택의 수를 나타냅니다. 이미지를 저장할 파일 폴더를 지정합니다. 이제 자동 이미징 프로그램을 실행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.