광활성성 펩타이드 MHC를 사용한 제어된 T 세포 활성화 평가

커버글라스를 비오티닐화된 폴리-L-라이신으로 코팅하여 비오틴이 풍부한 표면을 만듭니다.

다음으로, 비오틴에 결합하여 후속 상호 작용을 위한 분자 다리를 형성하는 단백질인 스트렙타비딘을 소개합니다.

그 후, 주요 조직 적합성 복합체(접착 분자와 함께 pMHC)에 결합된 비오티닐화된 광감형 펩타이드를 추가합니다.

비오티닐화된 pMHC 리간드와 접착 분자는 스트렙타비딘의 특정 영역과 상호 작용하여 고정화를 가능하게 합니다.

다음으로, 완충 식염수로 커버글라스를 반복적으로 세척하고 T 세포를 도입합니다.

펩타이드의 특정 잔기에 묶인 빛에 민감한 화학 그룹인 포토케이지의 존재는 펩타이드에 대한 T 세포 수용체의 자발적인 결합을 방해합니다.

제어된 T 세포 활성화를 위해 광감형 펩타이드를 자외선에 노출시킵니다.

자외선은 광감-펩타이드 복합체 사이의 화학 결합을 끊어 펩타이드의 천연 형태를 노출시킵니다.

T 세포 수용체는 노출된 펩타이드를 식별하고 부착하는 반면, 인테그린은 접착 분자에 결합하여 T 세포 활성화를 유발합니다.

먼저 비오티닐화된 폴리-L-라이신 또는 바이오-PLL을 증류된 탈이온수에서 1 내지 500으로 희석하여 8 8웰 챔버 커버 유리에 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 증류된 탈이온수로 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 건조시킵니다.

온에서 30분 동안 2% BSA가 포함된 HEPES 완충 식염수로 구성된 차단 완충액으로 바이오 PLL 코팅 표면을 차단합니다. 배양 후, 웰이 건조되지 않도록 바이오-PLL 코팅 표면에서 차단 완충액을 제거합니다. 그런 다음 스트렙타비딘을 첨가하고 섭씨 4도에서 배양합니다.

한 시간 후 HBS에서 코팅된 표면을 세척합니다. 챔버 슬라이드 웰을 4-5회 채우고 뒤집어 웰에서 HBS를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오.

CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 세포에 대한 특정 비오티닐화 광활성화성 펩타이드, 주요 조직 적합성 복합체 리간드 및 접착 분자를 바이오-PLL 코팅 표면에 추가합니다. 빛으로부터 보호하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 이전과 같이 세척하고 파종할 준비가 될 때까지 HBS에 그대로 둡니다. 마지막으로, 200,000개의 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 올바른 웰에 발현시켜 적절한 TCR을 발현하고 세포가 섭씨 37도에서 15분 동안 부착되도록 합니다.

세포가 표면에 부착되어 퍼지면 광활성화 및 이미징을 위한 준비가 됩니다. 이미지 획득을 위해 UV 호환 150x 대물 렌즈가 장착된 거꾸로 된 전체 내부 반사 형광 현미경을 사용하십시오. 각각 488나노미터 및 561나노미터 여기 레이저를 사용하여 녹색 및 빨간색 채널의 프로브를 모니터링합니다.

T 세포가 포함된 챔버 슬라이드를 장착한 후 필요에 따라 현미경 설정을 조정하여 TIRF 또는 낙산화 조명을 얻습니다. 라이브 모드에서 관심 있는 형광 프로브를 발현하는 세포 필드를 선택합니다. 소프트웨어 제어를 사용하여 개별 세포 아래에 광활성화를 위한 미크론 규모의 영역을 설정합니다. 그런 다음 획득을 시작합니다.

일반적으로 80개의 시점이 각 시점 사이에 5초의 간격으로 획득됩니다. 이것은 이중 색상 실험의 경우 순차적 488나노미터 및 563나노미터 노출을 위한 시간을 남깁니다. 그런 다음 10개의 시점을 획득한 후 디지털 조리개 셔터를 1-1.5초 동안 열어 선택한 영역을 사진 활성화합니다. 타임랩스가 완료되면 새 셀 필드를 선택하고 프로세스를 반복합니다.