광활성성 펩타이드 MHC를 사용한 제어된 T 세포 활성화 평가

먼저

커버글라스를 비오티닐화된 폴리-L-라이신으로 코팅하여 비오틴이 풍부한 표면을 만듭니다.

다음으로, 비오틴에 결합하여 후속 상호 작용을 위한 분자 다리를 형성하는 단백질인 스트렙타비딘을 소개합니다.

그 후, 주요 조직 적합성 복합체(접착 분자와 함께 pMHC)에 결합된 비오티닐화된 광감형 펩타이드를 추가합니다.

비오티닐화된 pMHC 리간드와 접착 분자는 스트렙타비딘의 특정 영역과 상호 작용하여 고정화를 가능하게 합니다.

다음으로, 완충 식염수로 커버글라스를 반복적으로 세척하고 T 세포를 도입합니다.

펩타이드의 특정 잔기에 묶인 빛에 민감한 화학 그룹인 포토케이지의 존재는 펩타이드에 대한 T 세포 수용체의 자발적인 결합을 방해합니다.

제어된 T 세포 활성화를 위해 광감형 펩타이드를 자외선에 노출시킵니다.

자외선은 광감-펩타이드 복합체 사이의 화학 결합을 끊어 펩타이드의 천연 형태를 노출시킵니다.

T 세포 수용체는 노출된 펩타이드를 식별하고 부착하는 반면, 인테그린은 접착 분자에 결합하여 T 세포 활성화를 유발합니다.

먼저 비오티닐화된 폴리-L-라이신 또는 바이오-PLL을 증류된 탈이온수에서 1 내지 500으로 희석하여 8 8웰 챔버 커버 유리에 첨가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 증류된 탈이온수로 세척한 다음 실온에서 2시간 동안 건조시킵니다.

실

온에서 30분 동안 2% BSA가 포함된 HEPES 완충 식염수로 구성된 차단 완충액으로 바이오 PLL 코팅 표면을 차단합니다. 배양 후, 웰이 건조되지 않도록 바이오-PLL 코팅 표면에서 차단 완충액을 제거합니다. 그런 다음 스트렙타비딘을 첨가하고 섭씨 4도에서 배양합니다.

한 시간 후 HBS에서 코팅된 표면을 세척합니다. 챔버 슬라이드 웰을 4-5회 채우고 뒤집어 웰에서 HBS를 제거합니다. 우물이 마르지 않도록 하십시오.

CD4 양성 T 세포 또는 CD8 양성 세포에 대한 특정 비오티닐화 광활성화성 펩타이드, 주요 조직 적합성 복합체 리간드 및 접착 분자를 바이오-PLL 코팅 표면에 추가합니다. 빛으로부터 보호하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 이전과 같이 세척하고 파종할 준비가 될 때까지 HBS에 그대로 둡니다. 마지막으로, 200,000개의 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 올바른 웰에 발현시켜 적절한 TCR을 발현하고 세포가 섭씨 37도에서 15분 동안 부착되도록 합니다.

세포가 표면에 부착되어 퍼지면 광활성화 및 이