항체 생체내 분포를 연구하기 위한 In Vivo Immunofluorescence 국소화 방법

유방암의 쥐 모델을 예로 들어 보겠습니다. 유선 종양은 암세포, 암 관련 섬유아세포, 지방세포, 면역 세포 및 종양 맥관 구조로 구성됩니다.

형광단 접합 종양 특이적 항체를 정맥 주사합니다.

종양 맥관 구조에 도달하면 항체는 혈관 내피 및 인근 암세포의 종양 특이적 막관통 단백질에 결합합니다.

외과적으로 유선을 분리하고 냉동 매체에 담급니다.

슬라이드에서 냉동 절편을 얻고 완충액으로 헹구어 동결 배지를 제거합니다.

조직 구조를 보존하기 위해 절편을 고정합니다. 면역염색을 강화하기 위해 세제를 바르고 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 용액을 바르십시오.

혈관 내피의 접착 분자에 특이적인 1차 항체와 1차 항체에 결합하여 맥관 구조를 표지하는 형광단 접합 2차 항체를 도입합니다.

슬라이드에 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 놓습니다.

공초점 현미경 아래에서 형광 표지된 종양 맥관 구조 내부 및 주변의 종양 특이적 항체의 생체 분포를 평가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마취 후 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비합니다. 알코올 물티슈로 세 번 닦아 동물의 꼬리를 소독하십시오. 열 패드로 약 30초 동안 따뜻하게 하여 꼬리 정맥을 확장합니다. 동물 전체를 가열하지 마십시오. 27게이지 테일 베인 카테터를 사용하여 나비 바늘을 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 삽입합니다.

카테터로의 혈액 역류를 시각화하여 바늘이 적절하게 배치되어 용액이 꼬리에 포착되지 않고 동물에게 완전히 들어가도록 합니다.

수술용 테이프를 사용하여 삽입된 바늘로 꼬리를 스테이지에 조심스럽게 고정합니다. 25마이크로리터의 멸균 인산염 완충 식염수로 카테터를 세척합니다. 그런 다음 인슐린 주사기를 사용하여 항체 용액을 카테터에 주입합니다. 25마이크로리터의 멸균 PBS로 카테터를 다시 한 번 세척합니다. 꼬리에서 바늘을 제거하고 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스의 인도적 안락사를 수행하고 마우스를 바로 누운 자세로 눕힙니다. 수술용 가위와 겸자를 사용하여 종양 조직을 절제합니다. 집게를 사용하여 꼬리에 가장 가까운 유선 세트 사이의 피부 바깥층만 잡고 수술용 가위로 작은 절개를 합니다. 닫힌 가위를 상처에 넣고 천천히 팁을 열어 피부를 밑에 있는 복벽막에서 조심스럽게 분리하여 손상되지 않은 상태로 유지합니다.

복부를 수직으로 절개하여 피부를 내막에서 계속 분리합니다. 세 번째와 네 번째 유선 사이에 복부를 가로질러 수평으로 절단하여 피부를 수축시키고 유선을 시각화할 수 있습니다. 집게로 각 종양이나 정상샘을 잡고 수술용 가위를 사용하여 부착된 피부를 조심스럽게 다듬습니다.

절제된 조직을 미리 라벨이 붙어 있고 최적의 절단 온도 포매 배지로 채워진 조직 일회용 베이스 몰드에 넣습니다. 드라이아이스 위에 올려 금형을 빠르게 얼립니다. 표적 이탈 전달을 연구하려면 관심 있는 다른 조직이나 기관을 절제하십시오. 저온 조절기를 사용하여 냉동 조직 블록을 10미크론 두께로 절편하고 인접한 절편을 미리 라벨이 붙은 접착 유리 슬라이드에 배치합니다.

냉동 조직 슬라이드를 실온 PBS로 5분 동안 헹구어 포매 배지를 제거합니다. 소수성 배리어 펜으로 조직 절편을 구분하여 염색 중에 필요한 용액의 양을 줄입니다. 조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액으로 5분 동안 고정합니다. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 헹군 후 PBS에서 0.5% Triton X-100으로 조직 절편을 15분 동안 투과화합니다. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 다시 헹굽니다.

실온에서 1시간 동안 부피당 3% 중량의 소 혈청 알부민과 부피당 5% 부피의 염소 혈청을 함유한 PBS로 조직을 차단합니다. 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 헹구고 나서, 일반적인 핵, 혈관 또는 세포질 마커와 같은 기록 보관 1차 항체와 함께 절편을 배양합니다. 여기서, 쥐 항-마우스 CD31을 차단 용액에서 1 내지 100 희석으로 사용한다. 1차 항체가 있는 슬라이드는 슬라이드 트레이에서 탈수로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 밤새 방치됩니다.

배양 후, 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 세 번 헹구십시오. 매번 PBS를 변경하십시오. 슬라이드를 2차 항체와 함께 배양하여 1차 항체를 표지합니다. 이 응용 프로그램의 경우 AlexaFluor-546 접합 염소 항토끼 항체를 사용하여 항-B7-H3 항체를 시각화하고, 차단 용액에서 AlexaFluor-488 염소 항쥐 2차 항체로 CD31을 시각화합니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 슬라이드 트레이에 놓아 빛과 탈수로부터 보호합니다.

이전과 같이 PBS로 슬라이드를 헹군 후 조직 조각의 중앙에 마운팅 매체 한 방울을 도포합니다. 기포가 끼지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 커버슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉하고 건조시키십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석을 진행합니다.