인간 식세포에 의한 Fungal Spore Phagocytosis의 정량적 유세포 분석 측정

인간 백혈구 현탁액이 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오. FITC 표지 병원성 진균 포자를 추가합니다.

배양하는 동안 포자는 팽창하고 단단한 소수성 단백질층을 파괴하여 식세포 세포의 특정 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 세포벽 다당류를 노출시킵니다.

이 결합은 세포 내 신호 전달 경로를 유발하여 파고좀 내에서 액틴 재배열 및 포자 내재화를 유도합니다.

식세포의 활성화 상태에 따라 일부 포자는 내재화 없이 세포에 부착된 상태로 남아 있습니다.

배양 후 세포를 수확하여 새 튜브로 옮깁니다.

원심 분리기. 세포를 완충액에 재현탁하고 멀티웰 V-바닥 플레이트로 옮깁니다.

부착된 포자에 노출된 FITC 분자에 결합하여 대조염색하는 형광단 표지 항-FITC 항체를 도입합니다.

원심 분리기. 세포를 완충액에 재현탁하고 유세포 분석기 튜브로 옮깁니다.

유세포 분석을 수행하여 내재화된 포자와 세포 부착 포자를 구별합니다.

내재화된 포자를 포함하는 식세포는 FITC 신호를 나타내는 반면, 부착된 포자가 있는 세포는 FITC 및 대대 염색 신호를 나타냅니다.

시작하려면 10% FCS가 보충된 RPMI 1.5밀리리터에 200만 개의 백혈구와 400만 개의 FITC 표지 분생자를 12웰 배양 플레이트로 옮깁니다. 분생자가 없는 세포만 대조군과 표지되지 않은 분생자가 있는 세포 대조군을 포함합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 가습된 이산화탄소 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확하고 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

먼저 각 샘플 및 대조군 100마이크로리터를 96웰 V-바닥 플레이트의 한 웰에 넣습니다. 세척을 위해 2밀리몰의 EDTA가 포함된 150마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 색상 보정을 위해 각 색상에 대해 분생자가 없는 100만 개의 세포를 플레이트의 다른 웰에 배치합니다. 긴장을 풀지 않은 채로 남겨질 세포의 우물을 포함하십시오. 세척을 위해 2밀리몰의 EDTA를 함유한 150마이크로리터의 PBS를 각 웰에 첨가합니다.

그런 다음 플레이트를 접착 호일로 덮고 실온에서 300배 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 호일을 제거하고 싱크대나 일회용 종이 타월 위에 접시를 한 번만 빠르고 강하게 뒤집어 상청액을 버립니다. 100마이크로리터의 항체 혼합물에 세포를 재현탁하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

색상 보상을 위해 2밀리몰의 EDTA를 함유한 100